血清氨基酸測定是臨床生化和代謝疾病診斷中的重要檢測項目，用于評估蛋白質代謝狀態(tài)、營養(yǎng)狀況、肝腎功能，并對遺傳性氨基酸代謝病(如苯丙酮尿癥、楓糖尿癥、高胱氨酸尿癥等)進行篩查和診斷。

　　一、測定方法

　　目前血清氨基酸的測定主要依賴于高靈敏度、高特異性的分析技術，常用方法如下：

　　1. 高效液相色譜法(HPLC)

　　原理：

　　血清樣本中的氨基酸與衍生化試劑(如鄰苯二甲醛 OPA、芴甲氧羰酰氯 FMOC-Cl、丹磺酰氯 DNS-Cl)反應，生成具有熒光或紫外吸收的衍生物。

　　通過反相HPLC分離，熒光或紫外檢測器檢測。

　　優(yōu)點：

　　分離效果好，可同時檢測20種以上常見氨基酸。

　　靈敏度高(可達 nmol/L 級)。

　　重復性好，適合臨床常規(guī)檢測。

　　缺點：

　　衍生化步驟繁瑣，耗時。

　　部分氨基酸(如半胱氨酸)穩(wěn)定性差。

　　應用：臨床實驗室常用方法之一。

　　2. 液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)

　　原理：

　　氨基酸經簡單衍生或直接進入LC系統(tǒng)分離。

　　通過電噴霧電離(ESI) 進入質譜，利用多反應監(jiān)測(MRM) 模式進行高選擇性、高靈敏度檢測。

　　優(yōu)點：

　　靈敏度極高(可檢測 pmol/L 級)。

　　特異性強，抗干擾能力強。

　　可同時檢測數(shù)十種氨基酸及代謝物(如?；鈮A)。

　　樣品前處理相對簡單(常采用蛋白沉淀法)。

　　缺點：

　　儀器昂貴，維護成本高。

　　需要專業(yè)技術人員操作。

　　應用：

　　新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質譜篩查(MS/MS screening)。

　　復雜代謝病的確診與監(jiān)測。

　　代謝組學研究。

　　3. 氨基酸分析儀(離子交換色譜法)

　　原理：

　　使用陽離子交換樹脂分離氨基酸。

　　洗脫液與茚三酮(Ninhydrin) 反應生成紫色化合物(Ruhemann's purple)，在570 nm檢測(脯氨酸和羥脯氨酸為黃色，440 nm檢測)。

　　優(yōu)點：

　　經典方法，結果穩(wěn)定可靠。

　　可分離所有蛋白氨基酸。

　　缺點：

　　分析時間長(通常1–2小時/樣本)。

　　儀器體積大，自動化程度較低。

　　茚三酮試劑不穩(wěn)定，需現(xiàn)配現(xiàn)用。

　　應用：部分大型醫(yī)院或研究機構仍在使用。

　　4. 酶法(單一氨基酸檢測)

　　原理：利用特定酶催化反應，通過檢測NADH/NADPH吸光度變化定量。

　　例如：L-乳酸脫氫酶偶聯(lián)法測丙氨酸。

　　優(yōu)點：操作簡單，適合自動化生化分析儀。

　　缺點：只能測單一氨基酸，無法全面評估氨基酸譜。

　　應用：僅用于特定項目(如血氨、谷氨酰胺等)。

　　5. 毛細管電泳法(CE)

　　原理：基于氨基酸在電場中的遷移率差異進行分離，常與激光誘導熒光(LIF)聯(lián)用。

　　優(yōu)點：分離效率高，樣品用量少。

　　缺點：重現(xiàn)性較差，應用不廣泛。

　　二、標準操作流程(以LC-MS/MS為例)

　　樣本采集：空腹靜脈血 3–5 mL，注入無抗凝劑試管。

　　室溫凝固30分鐘，2000–3000 rpm離心10分鐘，分離血清。

　　立即測定或-80℃保存(避免氨基酸降解)。

　　樣本前處理：取血清50–100 μL。

　　加入有機溶劑(如甲醇、乙腈)沉淀蛋白，渦旋，離心。

　　取上清液，氮氣吹干，復溶于流動相或衍生化試劑中。

　　衍生化(如需)：使用OPA、AQC等試劑進行柱前衍生。

　　LC-MS/MS分析：進樣，梯度洗脫分離。

　　MRM模式檢測各氨基酸特征離子對。

　　定量分析：使用內標法(如使用穩(wěn)定同位素標記的氨基酸，如13C、1?N標記物)進行精確定量。

　　通過標準曲線計算濃度。