透射電鏡(TEM)是病毒粒子形態(tài)觀察和濃度估算的重要工具，其檢測流程需結(jié)合樣本制備與定量分析技術(shù)。下面是關(guān)鍵方法及注意事項：

　　一、樣本制備與濃度控制

　　?樣本純化?

　　病毒懸液需通過超速離心(100,000g)或過濾純化，去除細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，避免干擾成像?。

　　推薦濃度范圍：5 mg/mL左右，過高易導(dǎo)致顆粒堆積，過低則難以捕捉目標(biāo)結(jié)構(gòu)?。

　　?負(fù)染技術(shù)?

　　使用1%-2%磷鎢酸或醋酸雙氧鈾染液，染色時間30秒-1分鐘，可清晰顯示病毒輪廓?。

　　銅網(wǎng)需經(jīng)等離子體清洗增強吸附性，滴加5-10μL樣本后靜置10-15分鐘?。

　　二、電鏡參數(shù)與定量分析

　　?成像條件?

　　加速電壓80-120kV，放大倍數(shù)20,000-100,000倍，適用于30-150nm病毒顆粒觀察?。

　　低劑量模式(Low-dose mode)減少樣本損傷?。

　　?濃度估算方法?

　　?直接計數(shù)法?：通過電鏡圖像統(tǒng)計單位面積內(nèi)病毒顆粒數(shù)，結(jié)合樣本稀釋倍數(shù)計算濃度?。

　　?標(biāo)準(zhǔn)曲線法?：已知濃度的病毒樣本建立顆粒數(shù)與吸光度關(guān)系曲線，用于未知樣本推算?。

　　三、與其他定量技術(shù)的對比

　　?動態(tài)光散射(MADLS)?

　　可快速測定病毒顆粒濃度(如AAV樣本濃度與ELISA結(jié)果相關(guān)性良好)，但需注意聚集體干擾?。

　　?酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)?

　　通過病毒衣殼蛋白定量，適用于高濃度樣本，但無法區(qū)分完整/破損顆粒?。

　　四、注意事項

　　樣本保存：短期4℃保存≤2天，長期需-80℃分裝，避免反復(fù)凍融?。

　　染色優(yōu)化：磷鎢酸pH需調(diào)至6.5-7.0，染色不均時建議先用戊二醛固定?。