負(fù)染色技術(shù)是一種制備電子顯微鏡樣品圖像呈現(xiàn)復(fù)反差的技術(shù)。用于觀察樣品中的顆粒性物質(zhì)或生物大分子。用金屬鹽對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色，使整個(gè)載網(wǎng)都鋪上一層重金屬鹽，而有凸出顆粒的地方則沒有染料沉積。染色后，在電鏡下觀察時(shí)，被觀察的對象為亮的，背景為暗的。負(fù)染色是只染背景而不染樣品，與光學(xué)顯微鏡樣品的染色正好相反。目前常用的負(fù)染液是醋酸鈾或者磷鎢酸。

在負(fù)染色技術(shù)中，主要步驟包括：
1. 樣品準(zhǔn)備：首先，將稀釋后的生物樣品滴在載網(wǎng)上，通常是涂布在一個(gè)網(wǎng)格狀的銅或鎳網(wǎng)上的小洞（也稱井）內(nèi)。
2. 負(fù)染色劑添加：隨后迅速滴加一種高電子密度的染色劑，如磷鎢酸（Phosphotungstic acid, PTA）、醋酸鈾（Uranyl acetate）等。這些染料對電子束有很強(qiáng)的散射作用，在TEM下顯示出明顯的暗色背景。
3. 吸附與干燥：染色劑溶液圍繞并滲透進(jìn)入樣品內(nèi)部，但不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，而是通過物理吸附形成一層包裹樣品的高密度外殼。然后樣品經(jīng)過自然揮發(fā)或加速干燥，使染色劑固定在樣品周圍及可能的部分內(nèi)部空隙中。
4. 電鏡觀察：在透射電鏡下觀察時(shí)，由于高電子密度的染色劑形成的背景區(qū)域?qū)﹄娮拥奈栈蛏⑸淠芰^強(qiáng)，因此在圖像上呈現(xiàn)為暗色；而樣品因其較低的電子密度相對顯得較為透明或亮色，從而與暗色背景形成鮮明對比，使得樣品的輪廓和形態(tài)特征得以清晰顯現(xiàn)。

 

1.樣本量及寄送要求：
（1）液體樣品提供至少100μl，并配置好合適的濃度（上機(jī)前直接滴加樣品，不做稀釋或濃縮），濃度、純度對拍攝效果影響比較大；
（2）粉末樣品30mg左右，并注明溶劑類型及配置比例；
（3）外泌體樣品100μL，干冰運(yùn)輸寄送（不少于10kg干冰）；
（4）病毒要滅活后寄送，4℃運(yùn)輸寄送；
（5）細(xì)菌樣品，4℃運(yùn)輸寄送。
 2.樣品注意運(yùn)輸方式，需要冰袋或者干冰運(yùn)輸?shù)恼執(zhí)崆罢f明，并附詳細(xì)送檢要求的預(yù)約單。
   負(fù)染色的效果可能受到樣本的運(yùn)輸時(shí)間影響，如需負(fù)染色，關(guān)于樣本準(zhǔn)備和測試安排，請?zhí)崆芭ce測試工作人員溝通確認(rèn)。
3.測試周期：一般為樣品接收后的1周左右，如遇法定假期需要順延，具體實(shí)驗(yàn)周期及送樣時(shí)間請與e測試工作人員溝通確認(rèn)，謝謝！
4.交付數(shù)據(jù)：每樣提供10張拍攝圖片（不提供分析服務(wù)）。如需更多照片請?zhí)崆芭ce測試工作人員溝通確認(rèn)，并且會(huì)產(chǎn)生額外費(fèi)用，請悉知！結(jié)果反饋請?jiān)跍y試完成一周內(nèi)，不建議回收樣品，如有需要請?zhí)崆胺答伣oe測試工作人員。

 

參考圖