熒光原位雜交技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù),原理是利用報(bào)告分子(如生物素、地高辛等)標(biāo)記核酸探針,然后將探針與染色體或DNA纖維切片上的靶DNA雜交,若兩者同源互補(bǔ),即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。此時(shí)可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng),經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對(duì)待DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。
1. 送樣要求
1. 包埋:石蠟包埋、OTC包埋。
(1) 標(biāo)本要求:已固定在4%多聚甲醛中的動(dòng)物組織,或已固定在FAA中的植物組織。
(2) 送樣要求:
a. 動(dòng)物組織:處死動(dòng)物后立即取材,生理鹽水沖洗表面,4%的多聚甲醛固定,一般組織固定48h左右進(jìn)行包埋z好,大小不超過1cm*1cm*0.5cm,裝組織的管子一定要比組織大,固定液是樣品體積的5倍以上,以保證充分固定,封口膜封好避免運(yùn)輸過程中固定液灑出。
b. 植物組織:新鮮取材后固定于FAA固定液中,大小不超過1cm*1cm*0.5cm,如果組織懸浮于固定液上,可以抽真空使其下沉。
注:常溫或少量冰袋運(yùn)輸。
2. 切片:石蠟切片、冰凍切片。
(1) 標(biāo)本要求:已包埋的動(dòng)物/植物組織 。
(2)送樣要求:
a. 石蠟包埋的組織:冰袋運(yùn)輸。
b. OTC包埋的組織:干冰運(yùn)輸。
3. 染色:脫蠟至水、蘇木素染色、伊紅染色、脫水封片。
(1) 標(biāo)本要求:切片。
(2) 送樣要求:
a. 石蠟切片:石蠟切片碼齊裝在塑料切片盒中,冰袋運(yùn)輸。
b. 冰凍切片:冰凍切片碼齊裝在塑料切片盒中,干冰運(yùn)輸。
4. 拍照:光學(xué)拍照(白光)、數(shù)字掃描(白光)
(1) 標(biāo)本要求:已染色的切片。
(2) 送樣要求:已染色的切片,常溫或少量冰袋運(yùn)輸。
油菜花蕾:
1、原位雜交雜交液作用
(1)雜交液內(nèi)除含一定濃度的標(biāo)記探針外,還含有較高濃度的鹽類、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等。 (2)雜交液中含有較高濃度的Na+可使雜交率增加,可以減低探針與組織標(biāo)本之間的靜電結(jié)合。 (3)甲酰胺可使雜交溫度降低,所以雜交液中加入適量的甲酰胺,可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞以及標(biāo)本的脫落。 (4)硫酸葡聚糖能與水結(jié)合,從而減少雜交液的有效容積,提高探針有效濃度,以達(dá)到提高雜交率的目的。
2、原位雜交探針濃度
(1)探針濃度依其種類和實(shí)驗(yàn)要求略有不同,一般為0.5—5.0 ug/ml(0.5—5.0 ng/ ul)。
(2)適宜的探針濃度要通過實(shí)驗(yàn)才能確定。
(3)探針的長度一般應(yīng)在50-300個(gè)堿基之間,z長不宜超過400個(gè)堿基。
(4)探針短易進(jìn)入細(xì)胞,雜交率高,雜交時(shí)間短。