1. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)——金標(biāo)準(zhǔn)

　　原理：

　　水解液或去蛋白上清進(jìn)樣。

　　液相色譜(LC)分離氨基酸。

　　串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下高選擇性檢測(cè)。

　　使用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)(如13C、1?N標(biāo)記氨基酸)進(jìn)行精確定量。

　　優(yōu)點(diǎn)：

　　靈敏度極高(可達(dá) pmol/L 級(jí))。

　　特異性強(qiáng)，抗基質(zhì)干擾。

　　可同時(shí)檢測(cè)50種以上氨基酸及代謝物。

　　通量高，適合復(fù)雜食品基質(zhì)。

　　缺點(diǎn)：

　　儀器昂貴，維護(hù)成本高。

　　需專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員操作。

　　應(yīng)用：高端研究、代謝組學(xué)、新生兒篩查衍生技術(shù)、精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)評(píng)估。

　　2. 高效液相色譜法(HPLC)——常用

　　柱前衍生-HPLC法(主流方法)：

　　衍生試劑：

　　OPA(鄰苯二甲醛)：與伯胺反應(yīng)，生成熒光產(chǎn)物(用于谷氨酸、賴(lài)氨酸等)，激發(fā)340 nm，發(fā)射455 nm。

　　FMOC-Cl(芴甲氧酰氯)：與仲胺反應(yīng)(用于脯氨酸、羥脯氨酸)。

　　AQC(6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate)：穩(wěn)定性好，適用于所有氨基酸，推薦用于常規(guī)檢測(cè)。

　　檢測(cè)：反相HPLC + 熒光或紫外檢測(cè)。

　　優(yōu)點(diǎn)：

　　分離效果好，重復(fù)性高。

　　成本適中，適合大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室。

　　方法成熟，標(biāo)準(zhǔn)化程度高。

　　缺點(diǎn)：

　　衍生化步驟繁瑣，耗時(shí)。

　　衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性差(尤其OPA)。

　　標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)：GB 5009.124-2016 推薦使用 AQC 或 OPA/FMOC 衍生化 HPLC 法。

　　3. 氨基酸分析儀(離子交換色譜-茚三酮法)

　　原理：

　　水解液注入陽(yáng)離子交換柱。

　　梯度洗脫分離氨基酸。

　　與茚三酮在加熱條件下反應(yīng)，生成紫色化合物(570 nm，除脯氨酸)或黃色化合物(440 nm，脯氨酸類(lèi))。

　　連續(xù)檢測(cè)吸光度。

　　優(yōu)點(diǎn)：

　　經(jīng)典方法，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

　　可分離所有蛋白源氨基酸。

　　缺點(diǎn)：

　　分析時(shí)間長(zhǎng)(1–2小時(shí)/樣本)。

　　茚三酮試劑腐蝕性強(qiáng)，需通風(fēng)櫥操作。

　　靈敏度低于LC-MS/MS。

　　應(yīng)用：部分大型檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)、研究單位仍在使用。

　　4. 毛細(xì)管電泳法(CE)

　　原理：基于氨基酸在電場(chǎng)中的遷移率差異分離，常與激光誘導(dǎo)熒光(LIF)聯(lián)用。

　　優(yōu)點(diǎn)：樣品用量少，分離效率高。

　　缺點(diǎn)：重現(xiàn)性較差，應(yīng)用不廣泛。

　　5. 酶法與快速檢測(cè)

　　酶法：

　　如谷氨酸脫氫酶法測(cè)谷氨酸，通過(guò)NADH吸光度變化定量。

　　優(yōu)點(diǎn)：可在生化分析儀上自動(dòng)化檢測(cè)。

　　缺點(diǎn)：只能測(cè)單一氨基酸。

　　試紙/比色法：

　　用于現(xiàn)場(chǎng)快速篩查(如醬油中谷氨酸鈉含量)。

　　靈敏度和準(zhǔn)確性較低。