在代謝組學(xué)研究中，脂肪酸(Fatty Acids, FAs)的測(cè)定是核心內(nèi)容之一，因?yàn)橹舅岵粌H是能量?jī)?chǔ)存和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵組分，還作為信號(hào)分子(如前列腺素、白三烯)參與多種生理和病理過(guò)程。代謝組學(xué)中的脂肪酸分析旨在全面、定量地檢測(cè)生物樣本中游離脂肪酸(Free Fatty Acids, FFAs)以及作為復(fù)雜脂質(zhì)組成部分的脂肪酸。

　　一、 脂肪酸在代謝組學(xué)中的重要性

　　能量代謝：長(zhǎng)鏈脂肪酸是β-氧化的主要底物，為機(jī)體提供能量。

　　膜組成：脂肪酸的鏈長(zhǎng)和不飽和度直接影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性、通透性和功能。

　　信號(hào)傳導(dǎo)：ω-3和ω-6多不飽和脂肪酸(PUFAs)是類二十烷酸(eicosanoids)等炎癥和免疫調(diào)節(jié)分子的前體。

　　疾病標(biāo)志物：脂肪酸譜的改變與肥胖、2型糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、癌癥等多種代謝性疾病密切相關(guān)。

　　二、 測(cè)定方法

　　代謝組學(xué)中脂肪酸的測(cè)定主要依賴于色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，因其高靈敏度、高選擇性和能夠區(qū)分結(jié)構(gòu)異構(gòu)體(如順/反式、位置異構(gòu))。

　　1. 氣相色譜-質(zhì)譜法 (GC-MS) —— 傳統(tǒng)金標(biāo)準(zhǔn)

　　原理：脂肪酸通常以脂肪酸甲酯 (Fatty Acid Methyl Esters, FAMEs) 的形式進(jìn)行分析。長(zhǎng)鏈脂肪酸極性低、沸點(diǎn)高，直接GC分析困難，因此需要衍生化。

　　樣品前處理：

　　提取：使用有機(jī)溶劑(如氯仿/甲醇)從組織、血漿、細(xì)胞等樣本中提取總脂質(zhì)。

　　水解/轉(zhuǎn)酯化：

　　酸性甲醇解：在酸性條件下(如HCl/甲醇)，將甘油三酯、磷脂等復(fù)雜脂質(zhì)中的脂肪酸水解并轉(zhuǎn)化為FAMEs。

　　堿性甲醇解 (皂化)：先用KOH/NaOH水解酯鍵，釋放游離脂肪酸，再用酸性甲醇酯化。

　　色譜分離：FAMEs具有良好的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性，非常適合GC分離。使用極性或中等極性毛細(xì)管柱(如聚乙二醇柱)，可按碳鏈長(zhǎng)度和不飽和度有效分離。

　　質(zhì)譜檢測(cè)：電子轟擊電離(EI)產(chǎn)生特征碎片離子，易于與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)(如NIST, FAMEs數(shù)據(jù)庫(kù))比對(duì)進(jìn)行鑒定。

　　優(yōu)點(diǎn)：

　　分離效率高，可分辨順/反式異構(gòu)體(如反式脂肪酸)。

　　譜庫(kù)成熟，鑒定可靠。

　　定量準(zhǔn)確。

　　缺點(diǎn)：

　　必須衍生化，步驟繁瑣，可能引入誤差或損失。

　　高沸點(diǎn)、長(zhǎng)鏈或極性脂肪酸(如羥基脂肪酸)可能分解或峰拖尾。

　　無(wú)法保留原始脂質(zhì)分子信息(只知道脂肪酸組成，不知道其在哪個(gè)磷脂上)。

　　2. 液相色譜-質(zhì)譜法 (LC-MS) —— 現(xiàn)代主流方法

　　原理：無(wú)需衍生化，可直接分析游離脂肪酸或通過(guò)分析復(fù)雜脂質(zhì)(如磷脂、甘油三酯)的MS/MS譜圖來(lái)推斷其脂肪酸組成。

　　樣品前處理：

　　游離脂肪酸 (FFAs)：可用有機(jī)溶劑(乙醚、乙酸乙酯)從水相樣本(血清、尿液)中直接液液萃取。

　　總脂肪酸：先提取總脂質(zhì)，然后通過(guò)酸/堿水解或酶解(如脂肪酶)釋放所有脂肪酸，再進(jìn)行LC-MS分析。

　　間接分析：不水解，直接進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析，通過(guò)MS/MS確定每個(gè)脂質(zhì)分子的脂肪酸組成。

　　色譜分離：

　　反相液相色譜 (RPLC)：常用。使用C18柱，按脂肪酸的疏水性(碳鏈長(zhǎng)度和不飽和度)分離。不飽和度越高，保留時(shí)間越短。

　　超臨界流體色譜 (SFC)：新興技術(shù)，分離速度快，分辨率高，尤其適合脂質(zhì)和脂肪酸分析。

　　質(zhì)譜檢測(cè)：

　　電離方式：電噴霧電離(ESI)，負(fù)離子模式([M-H]?)對(duì)游離脂肪酸靈敏度高。

　　質(zhì)譜類型：三重四極桿(用于靶向定量)、高分辨質(zhì)譜(Q-TOF, Orbitrap，用于非靶向發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)確證)。

　　MS/MS：提供碎片離子，用于確認(rèn)脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度、雙鍵位置(需特殊技術(shù)如臭氧解、UVPD)和數(shù)量。

　　優(yōu)點(diǎn)：

　　無(wú)需衍生化，流程簡(jiǎn)單，通量高。

　　適用于極性脂肪酸和高分子量脂肪酸。

　　可與脂質(zhì)組學(xué)整合，實(shí)現(xiàn)“脂質(zhì)-脂肪酸”關(guān)聯(lián)分析。

　　缺點(diǎn)：

　　對(duì)順/反式異構(gòu)體的分離能力通常不如GC。

　　復(fù)雜樣本中基質(zhì)效應(yīng)可能影響定量。

　　三、 樣本類型

　　血液：血漿、血清(常用，反映系統(tǒng)代謝狀態(tài))。

　　組織：肝臟、脂肪、肌肉、腦組織等(反映局部代謝)。

　　細(xì)胞：培養(yǎng)細(xì)胞(用于機(jī)制研究)。

　　尿液：某些短鏈脂肪酸或代謝物。

　　糞便：腸道菌群相關(guān)脂肪酸(如短鏈脂肪酸SCFAs)。

　　四、 數(shù)據(jù)分析與解讀

　　定性：根據(jù)保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)(<5 ppm誤差)、MS/MS碎片模式與標(biāo)準(zhǔn)品或數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行鑒定。

　　定量：

　　靶向代謝組學(xué)：使用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)(如D?-棕櫚酸、13C-油酸)進(jìn)行絕對(duì)定量。

　　非靶向代謝組學(xué)：使用內(nèi)標(biāo)(如十五烷酸C15:0)進(jìn)行半定量或相對(duì)定量。

　　生物信息學(xué)：

　　計(jì)算關(guān)鍵指數(shù)：不飽和度指數(shù) (IUFA)、ω-6/ω-3 比值。

　　進(jìn)行主成分分析(PCA)、偏z小二乘判別分析(PLS-DA)尋找差異脂肪酸。

　　映射到脂肪酸代謝通路(如脂肪酸合成、β-氧化、去飽和酶活性)。

　　五、 關(guān)鍵注意事項(xiàng)

　　樣本采集與處理：

　　快速冷凍(液氮)，-80°C保存，防止脂肪酸降解或酶促修飾。

　　避免反復(fù)凍融。

　　使用抗氧化劑(如BHT)防止PUFAs氧化。

　　內(nèi)標(biāo)選擇：必須使用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)(如13C, D標(biāo)記)進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以校正提取效率和離子抑制。

　　質(zhì)量控制 (QC)：運(yùn)行過(guò)程中插入QC樣本(所有樣本的混合物)，監(jiān)控系統(tǒng)穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)質(zhì)量。

　　區(qū)分游離與結(jié)合態(tài)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需明確是測(cè)游離脂肪酸還是總脂肪酸。