TBA(Thiobarbituric Acid Reactive Substances, 硫代巴比妥酸反應(yīng)物)檢測是一種常用于評估脂質(zhì)過氧化程度的生化方法，尤其在研究氧化應(yīng)激相關(guān)疾病時(shí)非常重要。在腦組織切片中進(jìn)行TBA檢測，主要是為了測量脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物——丙二醛(MDA, Malondialdehyde)的含量，從而反映腦組織中的氧化損傷水平。

　　下面是腦組織切片中進(jìn)行TBA檢測的一般步驟和注意事項(xiàng)：

　　1. 樣品準(zhǔn)備

　　動(dòng)物處死與取樣：按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如小鼠或大鼠)，迅速取出腦組織，并根據(jù)需要分離特定區(qū)域(如海馬、皮層等)。

　　固定：將腦組織置于適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ褐?如4%多聚甲醛)，用于后續(xù)的切片處理。如果直接進(jìn)行生化分析，則可將組織保存于-80°C冰箱中備用。

　　2. 組織切片制備

　　脫水與透明化：將固定后的腦組織通過梯度乙醇脫水，再用二甲苯透明。

　　包埋：將組織包埋于石蠟中，制成石蠟塊。

　　切片：使用切片機(jī)將石蠟塊切成薄片(通常為5–10 μm厚)，貼附于載玻片上。

　　脫蠟與復(fù)水：依次用二甲苯去除石蠟，再通過降序乙醇系列處理回到水相環(huán)境。

　　3. TBA反應(yīng)

　　組織勻漿：如果是使用冷凍組織進(jìn)行MDA定量檢測，需先將腦組織剪碎后加入生理鹽水或緩沖液，在冰浴條件下用勻漿器制成勻漿。

　　TBA試劑反應(yīng)：

　　取適量組織勻漿或切片樣本，加入TBA試劑(通常包含TBA、三氯乙酸TCA和鹽酸)。

　　在高溫(如95°C)水浴中加熱30–60分鐘，使MDA與TBA反應(yīng)生成紅色的MDA-TBA加合物。

　　冷卻后離心，取上清液用于分光光度法檢測。

　　4. 檢測與定量

　　吸光度測定：使用分光光度計(jì)在532 nm波長處測定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度值。

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線法：使用已知濃度的MDA標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的吸光度值計(jì)算出MDA含量(通常以nmol/mg protein表示)。

　　蛋白濃度測定：同時(shí)使用BCA或Lowry法測定組織蛋白濃度，用于標(biāo)準(zhǔn)化MDA含量。

　　5. 顯微鏡觀察(可選)

　　若希望在組織水平觀察MDA分布，可采用免疫組織化學(xué)方法檢測MDA或相關(guān)氧化標(biāo)志物，而非直接使用TBA法。TBA法主要用于定量分析，不適合直接在切片上顯色定位。

　　注意事項(xiàng)

　　避免氧化干擾：操作過程中應(yīng)盡量避免樣本暴露于空氣中過久，防止額外氧化。

　　對照設(shè)置：設(shè)立陰性對照(如正常組)和陽性對照(如誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型組)以確保結(jié)果可靠性。

　　試劑新鮮配制：TBA試劑易分解，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

　　數(shù)據(jù)分析：結(jié)合其他氧化應(yīng)激指標(biāo)(如SOD、GSH-Px活性)綜合評估腦組織氧化狀態(tài)。