外泌體顆粒數(shù)檢測(cè)是評(píng)估外泌體數(shù)量和質(zhì)量的重要步驟，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和治療監(jiān)控。常用的外泌體顆粒數(shù)檢測(cè)方法及其詳細(xì)步驟和注意事項(xiàng)。

　　1. 納米顆粒跟蹤分析(NTA, Nanoparticle Tracking Analysis)

　　操作步驟：

　　樣品準(zhǔn)備：

　　收集樣本：從細(xì)胞培養(yǎng)上清液、血清、尿液等來(lái)源中收集含有外泌體的樣本。

　　預(yù)處理：通過(guò)低速離心(如300-500 g，10分鐘)去除大顆粒雜質(zhì)，然后通過(guò)超速離心(如100,000 g，70分鐘)分離外泌體，并用PBS或適當(dāng)?shù)木彌_液重懸。

　　稀釋?zhuān)焊鶕?jù)需要將樣品稀釋到合適的濃度，以確保每個(gè)視野中有適量的顆粒進(jìn)行追蹤。

　　儀器校準(zhǔn)：

　　打開(kāi)NTA設(shè)備并按照操作手冊(cè)進(jìn)行系統(tǒng)校準(zhǔn)，包括激光強(qiáng)度、相機(jī)設(shè)置等。

　　樣品加載：

　　將稀釋后的樣品注入NTA樣品池中，避免產(chǎn)生氣泡。

　　數(shù)據(jù)采集：

　　開(kāi)始視頻錄制，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)追蹤每個(gè)顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)軌跡，并計(jì)算其粒徑和濃度。

　　建議每個(gè)樣品至少記錄三個(gè)獨(dú)立的視頻片段，以確保結(jié)果的可靠性。

　　數(shù)據(jù)分析：

　　軟件會(huì)自動(dòng)生成顆粒大小分布圖和濃度報(bào)告。

　　根據(jù)需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步處理和統(tǒng)計(jì)分析。

　　注意事項(xiàng)：

　　確保樣品均勻分散，避免團(tuán)聚現(xiàn)象。

　　視頻長(zhǎng)度通常為30-60秒，可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。

　　2. 動(dòng)態(tài)光散射(DLS, Dynamic Light Scattering)

　　操作步驟：

　　樣品準(zhǔn)備：

　　類(lèi)似于NTA，收集并處理含有外泌體的樣本，使用適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋至合適濃度(通常在0.1-1 mg/mL之間)。

　　儀器校準(zhǔn)：

　　打開(kāi)DLS儀器，進(jìn)行必要的校準(zhǔn)和背景測(cè)量。

　　樣品加載：

　　將稀釋后的樣品加入樣品池中，確保樣品均勻混合。

　　數(shù)據(jù)采集：

　　運(yùn)行測(cè)量程序，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)記錄散射光信號(hào)的變化，并計(jì)算出粒子的平均尺寸和多分散性指數(shù)。

　　數(shù)據(jù)分析：

　　分析軟件會(huì)生成顆粒大小分布圖和濃度估算值。

　　注意DLS更適合用于較大顆粒的檢測(cè)，對(duì)于小顆粒(如外泌體)可能不如NTA精確。

　　注意事項(xiàng)：

　　DLS適合快速評(píng)估顆粒大小分布，但對(duì)于復(fù)雜樣品(如多種尺寸的顆粒共存)，其結(jié)果可能不夠準(zhǔn)確。

　　3. 高靈敏度流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry)

　　操作步驟：

　　樣品準(zhǔn)備：

　　收集并處理含有外泌體的樣本，必要時(shí)使用熒光標(biāo)記抗體標(biāo)記特定表面標(biāo)志物(如CD63、CD81)以提高檢測(cè)特異性。

　　對(duì)于高靈敏度流式細(xì)胞儀，可以使用微珠標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)校準(zhǔn)檢測(cè)范圍。

　　儀器校準(zhǔn)：

　　打開(kāi)流式細(xì)胞儀，進(jìn)行校準(zhǔn)，包括激光功率、光電倍增管電壓等參數(shù)設(shè)置。

　　樣品加載：

　　將標(biāo)記好的樣品通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)樣系統(tǒng)，確保樣品均勻流動(dòng)。

　　數(shù)據(jù)采集：

　　記錄每個(gè)事件的前向角散射光(FSC)、側(cè)向角散射光(SSC)及熒光信號(hào)。

　　設(shè)置合適的閾值以排除背景噪聲。

　　數(shù)據(jù)分析：

　　使用分析軟件生成直方圖和散點(diǎn)圖，根據(jù)熒光強(qiáng)度和散射光特征確定外泌體的數(shù)量和純度。

　　注意事項(xiàng)：

　　流式細(xì)胞術(shù)適合標(biāo)記特異性外泌體，但需要高質(zhì)量的標(biāo)記抗體和優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件。

　　需要使用高靈敏度流式細(xì)胞儀才能有效檢測(cè)納米級(jí)顆粒。

　　4. 透射電子顯微鏡(TEM, Transmission Electron Microscopy)

　　操作步驟：

　　樣品準(zhǔn)備：

　　收集并處理含有外泌體的樣本，通過(guò)超速離心分離外泌體。

　　制備超薄切片，將外泌體滴加到銅網(wǎng)上，負(fù)染后干燥。

　　電鏡觀察：

　　將銅網(wǎng)放入透射電鏡中，調(diào)整放大倍數(shù)和聚焦，找到外泌體顆粒進(jìn)行觀察和拍照。

　　數(shù)據(jù)分析：

　　通過(guò)圖像分析軟件手動(dòng)或自動(dòng)計(jì)數(shù)外泌體顆粒。

　　注意事項(xiàng)：

　　TEM提供高分辨率的圖像，但樣品制備過(guò)程復(fù)雜且耗時(shí)較長(zhǎng)。

　　適用于形態(tài)學(xué)和結(jié)構(gòu)分析，但不適合大規(guī)模定量分析。

　　總結(jié)

　　每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，選擇合適的方法取決于你的具體需求和實(shí)驗(yàn)條件：

　　NTA：適合快速、準(zhǔn)確地測(cè)定外泌體的顆粒數(shù)和大小分布。

　　DLS：適合快速評(píng)估顆粒大小分布，但對(duì)復(fù)雜樣品的精度較低。

　　流式細(xì)胞術(shù)：適合標(biāo)記特異性外泌體，但需要高靈敏度設(shè)備和優(yōu)化條件。

　　TEM：適合形態(tài)學(xué)和結(jié)構(gòu)分析，但不適合大規(guī)模定量分析。