使用透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope, TEM)拍攝細(xì)胞中的線粒體是一項(xiàng)精細(xì)且技術(shù)要求較高的實(shí)驗(yàn)操作。以下是詳細(xì)的步驟和注意事項(xiàng)，幫助你成功地進(jìn)行這項(xiàng)工作。

　　實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

　　材料與設(shè)備

　　樣品：含有線粒體的細(xì)胞或組織。

　　試劑：

　　緩沖液(如磷酸鹽緩沖液，PBS)

　　固定劑(如戊二醛、多聚甲醛)

　　脫水劑(乙醇系列)

　　滲透劑(如丙酮)

　　包埋劑(如環(huán)氧樹脂)

　　染色劑(如醋酸鈾、檸檬酸鉛)

　　儀器：

　　超薄切片機(jī)(Ultramicrotome)

　　透射電子顯微鏡(TEM)

　　離心機(jī)

　　冷凍超薄切片裝置(可選)

　　樣品處理步驟

　　1. 取樣與固定

　　取樣：迅速從培養(yǎng)皿或組織中取出所需的細(xì)胞或組織樣本，盡量保持其完整性。

　　預(yù)固定：將樣本置于4°C預(yù)冷的固定液(如2.5%戊二醛+0.1M PBS，pH 7.4)中固定1-2小時(shí)。

　　后固定：用1%鋨酸溶液在4°C下固定1-2小時(shí)，進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)比度。

　　2. 脫水與滲透

　　脫水：依次使用30%、50%、70%、80%、90%和1百%的乙醇進(jìn)行梯度脫水，每個(gè)濃度處理10-15分鐘。

　　滲透：用丙酮逐漸替代乙醇，z后用包埋劑(如Spurr樹脂)逐步替換丙酮。

　　3. 包埋與聚合

　　包埋：將處理好的樣本放入模具中，加入新鮮配制的包埋劑，確保樣本完全浸沒。

　　聚合：在60°C烘箱中聚合過夜，使樹脂充分硬化。

　　4. 切片與撈片

　　切片：使用超薄切片機(jī)將包埋塊切成約60-90納米厚的超薄切片。

　　撈片：用銅網(wǎng)撈起切片，并放置于濾紙上吸去多余液體。

　　5. 染色

　　負(fù)染：可選擇性地對(duì)某些樣品進(jìn)行負(fù)染處理，以提高圖像對(duì)比度。

　　重金屬染色：使用醋酸鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行雙染，通常分別染色10-15分鐘。

　　透射電鏡觀察

　　1. 樣品裝載

　　將染色后的銅網(wǎng)放置在專用的樣品臺(tái)上，確保其穩(wěn)固且無氣泡殘留。

　　2. 調(diào)整與觀察

　　調(diào)整參數(shù)：根據(jù)樣品特性調(diào)整加速電壓、放大倍數(shù)、聚焦等參數(shù)。

　　觀察與記錄：找到感興趣的區(qū)域(如線粒體)，調(diào)整至最佳成像條件并拍照記錄。

　　注意事項(xiàng)

　　避免污染：在整個(gè)過程中要特別注意防止灰塵和其他雜質(zhì)污染樣品。

　　操作精細(xì)：超薄切片過程需要極高的耐心和技巧，建議在有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員指導(dǎo)下進(jìn)行。

　　安全防護(hù)：部分試劑具有毒性，操作時(shí)應(yīng)佩戴手套、護(hù)目鏡，并在通風(fēng)良好的環(huán)境中進(jìn)行。