在進(jìn)行16S rRNA測序時(shí)，樣本的降解和污染是兩個(gè)常見的問題，它們可能嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。以下是針對這兩個(gè)問題的具體處理方法和預(yù)防措施：

　　樣本降解的處理

　　1. 預(yù)防措施

　　快速處理：采集樣本后盡快進(jìn)行DNA提取，以減少核酸酶對DNA的降解作用。

　　低溫保存：在運(yùn)輸和儲存過程中保持樣本低溫(如使用干冰或液氮)，以減緩DNA降解速度。

　　添加保護(hù)劑：某些情況下可以在樣本中添加DNA保護(hù)劑，如RNAlater等，以穩(wěn)定核酸。

　　2. 樣本質(zhì)量評估

　　凝膠電泳檢測：通過瓊脂糖凝膠電泳檢查提取的DNA完整性，觀察是否有明顯的降解片段。

　　光譜分析：使用分光光度計(jì)測量DNA濃度和純度(A260/A280比值)，高質(zhì)量的DNA應(yīng)接近1.8-2.0。

　　定量PCR(qPCR)：利用16S rRNA基因特異性引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，評估模板DNA的質(zhì)量和完整性。

　　3. 數(shù)據(jù)分析調(diào)整

　　選擇合適的區(qū)域：如果樣本有一定程度的降解，可以選擇較短的16S rRNA基因可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，例如V4區(qū)，因?yàn)槠溟L度較短，更易成功擴(kuò)增。

　　生物信息學(xué)修正：在數(shù)據(jù)分析階段，可以通過去除低質(zhì)量讀段、截短序列等方式提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。

　　污染的處理

　　1. 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制

　　分區(qū)操作：將DNA提取、PCR擴(kuò)增和文庫制備等步驟分別在不同的實(shí)驗(yàn)室區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，以避免交叉污染。

　　無菌技術(shù)：使用無菌耗材，佩戴手套和口罩，并定期清潔工作臺面和儀器。

　　負(fù)對照實(shí)驗(yàn)：每次實(shí)驗(yàn)都設(shè)置空白對照(如無菌水作為模板)，用于檢測是否存在外源性污染。

　　2. 樣本采集與處理

　　嚴(yán)格采樣流程：確保采樣工具和容器經(jīng)過充分滅菌，避免從外界引入污染物。

　　重復(fù)抽樣：對于關(guān)鍵樣本，建議進(jìn)行多次獨(dú)立采樣，以驗(yàn)證結(jié)果的一致性。

　　3. 數(shù)據(jù)過濾與校正

　　去除污染序列：通過與已知污染數(shù)據(jù)庫(如Mock社區(qū))比對，識別并去除潛在的污染序列。

　　統(tǒng)計(jì)分析修正：在多樣性分析中，可以使用去除低豐度OTU的方法來減輕污染的影響。

　　具體案例及應(yīng)對策略

　　假設(shè)你在分析某個(gè)土壤樣本時(shí)發(fā)現(xiàn)存在顯著的背景噪聲，可能是由于微量污染導(dǎo)致的：

　　首先確認(rèn)污染來源：檢查實(shí)驗(yàn)過程中的每一步驟，確定污染是否來自樣本采集、DNA提取還是PCR過程。

　　優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：增加重復(fù)樣本數(shù)量，改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，例如更換試劑批次或采用更嚴(yán)格的無菌操作標(biāo)準(zhǔn)。

　　數(shù)據(jù)分析時(shí)排除干擾：利用生物信息學(xué)工具對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行深度清洗，比如使用DADA2或Deblur算法來精q識別和去除污染序列。