免疫熒光實驗是一種用于研究生物學中抗原-抗體反應的應用技術，它是將熒光色素標記到抗體或抗原上，以便在熒光顯微鏡下觀察它們與其他相應抗原或抗體的特異性結(jié)合情況，下面就和醫(yī)學科研實驗外包公司e測試一起看看這個免疫熒光實驗具體應該如何操作吧!

　　免疫熒光實驗操作步驟如下：

　　1、細胞準備

　　(1)取出生長狀態(tài)良好的細胞，棄培養(yǎng)基，消化重懸細胞。

　　(2)將24孔圓形爬片放入24孔板的孔中。

　　(3)根據(jù)細胞生長特性取適量細胞于已鋪爬片的24孔板中，放入37℃孵箱培養(yǎng)。

　　2、固定

　　固定的目的，其實就是為了防止離體組織自溶抗原擴散。

　　(1)取出細胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗細胞3次。

　　(2)每孔加入1mL的4%多聚甲醛，室溫固定10-20min，棄去多聚甲醛;

　　(3)加入1mL的PBS清洗細胞，重復兩次。

　　3、通透

　　其目的是使抗體進入胞內(nèi)。

　　(1)每孔加入1mL的0.5% Triton-X100 ，室溫10min，棄去Triton-X100。

　　(2)加入1mL的PBS清洗細胞，5min，棄PBS。重復兩次。

　　4、封閉

　　每孔中加入1mL的3%BSA封閉液，室溫封閉1h。棄封閉液。醫(yī)學科研實驗外包公司提醒：從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，不然極易產(chǎn)生較高的背景。

　　5、一抗結(jié)合

　　(1)向爬片上滴加稀釋好的一抗，用錫箔紙包住24孔板外面，輕柔的將24 孔板放置于4℃冰箱中，過夜孵育。

　　(2)加入1mL的PBS清洗細胞，5min，棄PBS。重復五次。

　　6、二抗結(jié)合

　　(1)加封閉液稀釋的二抗室溫避光孵育1h。

　　(2)加入1mL的PBS清洗細胞，5min，棄PBS。重復五次。

　　7、DAPI染色

　　(1)按照1：4000比例用1×PBS稀釋DAPI工作液，并向每個孔中加入1mL的DAPI工作液，靜置染色10min，e測試提醒：注意避光。

　　(2)加入1mL的PBS清洗細胞，5min，棄PBS。重復三次。

　　8、封片及檢測

　　(1)將爬片小心取出，用吸水紙吸干多余液體，加5μl的抗熒光淬滅劑到載玻片上。

　　(2)將爬片倒置載玻片上，周圍涂指甲油固定。

　　(3)4℃暫存或直接激光共聚焦顯微鏡拍攝。