一、簡介

生物透射電鏡是觀察生物細(xì)胞樣品內(nèi)部形態(tài)的重要工具，其電壓在80-120kv可以降低生物樣品因高能電子束輻射而損傷的影響，同時(shí)依賴于生物樣品制備技術(shù)的發(fā)展，如超薄切片技術(shù)、負(fù)染色技術(shù)、冷凍制樣技術(shù)、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)等，廣泛應(yīng)用于組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、病毒學(xué)、病理學(xué)及材料學(xué)等多個(gè)學(xué)科的研究中。

二、制樣流程

1.取材及固定細(xì)胞/細(xì)菌、組織樣本：細(xì)胞團(tuán)要求至少半個(gè)綠豆大小。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌，離心收集，棄去培養(yǎng)液，加入2.5%戊二醛，于4°C保存。對于貼壁細(xì)胞，先倒去培養(yǎng)液，加入2.5%戊二醛，4°C固定15min，用細(xì)胞刮刮下，離心收集（固定液保留），于4°C保存。組織樣本，離體1-3min內(nèi)取樣，1mm3。如來不及修整組織大小可先于電鏡固定液內(nèi)固定半小時(shí)左右待組織變硬以后再修整組織進(jìn)行后固定。超出此范圍后組織會(huì)無法完全固定，后續(xù)實(shí)驗(yàn)無法完成，務(wù)必請重視此過程。固定時(shí)間：至少4個(gè)小時(shí)。

2.緩沖液沖洗：用0.1M磷酸漂洗液漂洗4次，每次15min；

3.后固定：用1%的餓酸?0.1M磷酸緩沖液（PH7.2）室溫（20°C）固定2-4小時(shí)（固定時(shí)間因樣品不同而適當(dāng)調(diào)整）；

4.洗酸：使用PBS緩沖液漂洗3次，每次15min。

5.梯度脫水：  30%乙醇    15min

                      50%乙醇    15min

                      70%乙醇    15min

                      90%乙醇    15min

                     100  %乙醇    20min    2次

                     100  %丙酮    20min    2次

                   （含水量多、細(xì)胞膜厚的樣品可適當(dāng)延長脫水時(shí)間）。

6.滲透

                      丙酮：環(huán)氧樹脂1：1    1h

                      丙酮：環(huán)氧樹脂1：3    3h

                      純環(huán)氧樹脂                  12h

7.包埋

   將滲透好的樣品放入膠囊或包埋板中，加入包埋劑環(huán)氧樹脂，在 60℃度溫箱中聚合 48 h。

8.超薄切片

  切片厚度：70 nm。

9.雙染色

  鈾鉛雙染色（2%醋酸鈾飽和水溶液，枸櫞酸鉛，室溫染色 15 min），切片室溫干燥過夜。

  由于生物樣品主要由碳、氫、氧、氮等輕元素組成。這些元素原子對電子的散射能力很弱，相互之間的差別也很小。尤其生物超薄切片被樹脂所包埋，這些包埋樹脂對電子的散射能力與樣品本身差別很小。因此生物樣品超薄切片觀察時(shí)像的反差極弱。為了提高圖像的反差，要對超薄切片進(jìn)行電子染色。這里所謂電子染色是根本不同于光學(xué)顯微鏡的染色，它是利用重金屬鹽（如鉛鹽、鈾鹽等）與細(xì)胞的某些成分或結(jié)構(gòu)結(jié)合，由于重金屬對電子散射能力很強(qiáng)，使那些與其結(jié)合的結(jié)構(gòu)或成分對電子散射能力增強(qiáng)，從而達(dá)到提高樣品本身反差的。目前常用的染色劑是醋酸鈾和檸檬酸鉛染色液。操作流程是：超薄切片先檸檬酸鉛染色10分鐘，去二氧化碳的雙蒸水清洗3次，再用醋酸鈾染色10-30分鐘，雙蒸水清洗3次，等超薄切片干燥后，即可上透射電鏡觀察。（百度搜索）

10.透射電鏡觀察。

二、制樣視頻

視頻路徑：釘釘云智商學(xué)院（付曉陽）