掃描電鏡(Scanning Electron Microscopy, SEM)是一種用于觀察樣品表面微觀形貌的強(qiáng)大工具。對(duì)于乳酸菌這樣的微生物，通過SEM可以清晰地看到其細(xì)胞形態(tài)、大小以及表面結(jié)構(gòu)等細(xì)節(jié)。以下是進(jìn)行乳酸菌的掃描電鏡制樣的基本步驟和技術(shù)要點(diǎn)：

　　樣品準(zhǔn)備

　　培養(yǎng)與收集

　　在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)乳酸菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的生長(zhǎng)階段。

　　使用無菌技術(shù)小心收集細(xì)菌懸液，盡量減少外界污染。

　　清洗

　　為了去除培養(yǎng)基成分和其他雜質(zhì)，通常需要將收集到的細(xì)菌懸液用磷酸鹽緩沖液(PBS)或其他適合的緩沖液洗滌幾次。離心機(jī)在低速下操作以避免損傷細(xì)胞。

　　固定

　　將清洗后的細(xì)菌沉淀重新懸浮于固定液中，常用的固定劑包括2.5%的戊二醛或4%的多聚甲醛。固定時(shí)間一般為1-2小時(shí)，具體時(shí)間和濃度可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。

　　后固定(如果需要)

　　可選步驟，使用1%的鋨酸進(jìn)一步固定，這有助于增強(qiáng)細(xì)胞膜和細(xì)胞器的對(duì)比度。

　　脫水

　　使用一系列乙醇梯度(例如30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%)逐步替換掉樣品中的水分，每一步處理時(shí)間為10-15分鐘。z后可以用乙酸異戊酯代替100%乙醇來改善后續(xù)干燥過程的效果。

　　干燥

　　對(duì)于微生物樣品，臨界點(diǎn)干燥是一個(gè)常用的方法，它可以在不引起樣品塌陷的情況下去除殘留的液體。臨界點(diǎn)干燥機(jī)使用二氧化碳作為介質(zhì)，在特定的壓力和溫度條件下實(shí)現(xiàn)干燥。

　　導(dǎo)電涂層

　　由于生物樣品本身不導(dǎo)電，直接觀察可能會(huì)導(dǎo)致圖像失真或損壞樣品。因此，在SEM觀察前需要在樣品表面涂覆一層薄薄的導(dǎo)電材料，如金、鈀或碳。這可以通過濺射鍍膜機(jī)完成。

　　成像

　　放置樣品

　　小心地將處理好的樣品放置在SEM樣品臺(tái)上，并確保其穩(wěn)固且不會(huì)移動(dòng)。

　　調(diào)整參數(shù)

　　打開SEM設(shè)備，調(diào)節(jié)加速電壓、工作距離、放大倍數(shù)等參數(shù)，以獲得z佳成像效果。對(duì)于乳酸菌這類小型微生物，可能需要較高的放大倍數(shù)。

　　觀察與記錄

　　開始掃描并實(shí)時(shí)觀察樣品表面的微觀結(jié)構(gòu)。利用SEM自帶的軟件系統(tǒng)捕捉高分辨率的電子顯微照片。