考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)是一種常用的蛋白質(zhì)定量方法，基于考馬斯亮藍(lán)G-250染料與蛋白質(zhì)的相互作用引起顏色變化，通過(guò)比色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。以下是該方法的關(guān)鍵內(nèi)容：

　　一、原理

　　染料結(jié)合機(jī)制：在酸性條件下，考馬斯亮藍(lán)G-250呈紅色(z大吸收峰465nm);與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色(z大吸收峰595nm)。顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。

　　結(jié)合位點(diǎn)：主要與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸)以及芳香族氨基酸結(jié)合。

　　二、實(shí)驗(yàn)步驟

　　試劑配制

　　Bradford工作液：考馬斯亮藍(lán)G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85%磷酸，定容至1L，過(guò)濾后避光保存。

　　標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：常用牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)配制梯度濃度(如0.2-1.5 mg/ml)。

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

　　取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(如0、10、20…100μl)加入試管，補(bǔ)加緩沖液至相同體積。

　　每管加入5ml Bradford工作液，混勻后靜置5分鐘。

　　測(cè)定595nm處吸光度(A595)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(濃度 vs. A595)。

　　樣品測(cè)定

　　未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同法處理，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。

　　三、注意事項(xiàng)

　　靈敏度

　　檢測(cè)范圍通常為1-2000 μg/ml，適合微量蛋白質(zhì)檢測(cè)。

　　干擾物質(zhì)

　　強(qiáng)堿性緩沖液(如Tris、EDTA)、去垢劑(SDS、Triton X-100)、高鹽濃度可能影響結(jié)果。

　　解決方法：稀釋樣品或透析去除干擾物。

　　操作要點(diǎn)

　　反應(yīng)需在5-15分鐘內(nèi)完成，避免顏色沉淀。

　　混合時(shí)避免氣泡，使用相同比色皿以減少誤差。

　　四、優(yōu)缺點(diǎn)

　　優(yōu)點(diǎn)：

　　快速(5-10分鐘)、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高。

　　無(wú)需加熱，對(duì)還原劑耐受性較好。

　　缺點(diǎn)：

　　不同蛋白質(zhì)結(jié)合能力差異大(如IgG比BSA顯色弱)。

　　高濃度去垢劑或脂類會(huì)干擾結(jié)果。

　　五、常見(jiàn)問(wèn)題與解決

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線非線性：檢查標(biāo)準(zhǔn)品是否降解，或稀釋是否準(zhǔn)確。

　　吸光值過(guò)高/低：調(diào)整樣品濃度至線性范圍內(nèi)。

　　顏色不穩(wěn)定：確保避光操作，嚴(yán)格計(jì)時(shí)。

　　六、應(yīng)用場(chǎng)景

　　適用于細(xì)胞裂解液、純化蛋白、酶活測(cè)定等常規(guī)定量，但需注意與BCA法或Lowry法互補(bǔ)使用(如含去垢劑時(shí)優(yōu)先選BCA法)。