血清轉(zhuǎn)錄組測序是一種通過高通量測序技術(shù)分析血清中游離RNA(如mRNA、miRNA、lncRNA等)的方法，主要用于探索疾病生物標(biāo)志物、監(jiān)測疾病進(jìn)展及研究宿主-病原體互作。由于血清中RNA含量低且易降解，需嚴(yán)格優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程。下面是詳細(xì)步驟與技術(shù)要點(diǎn)：

　　一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要點(diǎn)

　　1. 樣本類型選擇

　　適用場景：

　　液體活檢(如癌癥早期診斷、治療效果監(jiān)測)。

　　感染性疾病研究(如病毒載量動(dòng)態(tài)、宿主免疫應(yīng)答)。

　　對照設(shè)置：

　　健康對照組與疾病組配對采集(年齡、性別匹配)。

　　采集時(shí)間點(diǎn)統(tǒng)一(如治療前、治療后1周)。

　　2. 樣本量計(jì)算

　　z低樣本量：每組至少15例(滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性要求)。

　　重復(fù)實(shí)驗(yàn)：技術(shù)重復(fù)(同一樣本分3次提取)驗(yàn)證數(shù)據(jù)穩(wěn)定性。

　　二、樣本采集與處理

　　1. 采血與分離

　　采血要求：

　　使用無RNA酶采血管(如PAXgene Blood RNA Tube)。

　　采血后室溫靜置30分鐘，4℃離心(2000×g，10分鐘)分離血清。

　　分裝保存：

　　每管分裝200 μL血清，液氮速凍后-80℃保存(避免反復(fù)凍融)。

　　2. RNA提取

　　試劑盒選擇：

　　針對游離RNA：Qiagen miRNeasy Serum/Plasma Kit(回收小RNA)。

　　外泌體RNA：結(jié)合超速離心(100,000×g，2小時(shí))或試劑法(ExoQuick)富集外泌體后提取。

　　質(zhì)量控制：

　　使用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA完整性(RIN≥7為佳，但血清RNA通常碎片化嚴(yán)重)。

　　Qubit定量(要求總RNA≥1 ng/μL，否則需擴(kuò)增)。

　　三、文庫構(gòu)建與測序

　　1. 文庫制備

　　小RNA測序：

　　適用miRNA、piRNA等(18~30 nt)，使用NEBNext Small RNA Library Prep Kit。

　　片段選擇：切膠回收140~160 bp文庫(適配器+插入片段)。

　　全轉(zhuǎn)錄組測序：

　　針對mRNA、lncRNA，需rRNA去除(如Ribo-Zero Gold Kit)，使用SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit。

　　2. 測序策略

　　平臺選擇：

　　Illumina NovaSeq 6000(高深度，推薦PE150)。

　　數(shù)據(jù)量：

　　小RNA測序：10~20 million reads/sample。

　　全轉(zhuǎn)錄組測序：50~100 million reads/sample。

　　四、數(shù)據(jù)分析流程

　　1. 原始數(shù)據(jù)處理

　　質(zhì)控過濾：

　　FastQC評估原始數(shù)據(jù)質(zhì)量，Trimmomatic去除低質(zhì)量序列(Phred score<20)。

　　去接頭：Cutadapt去除Illumina適配器。

　　宿主RNA去污染(可選)：

　　比對至宿主基因組(如hg38)，提取未比對序列用于病原體分析。

　　2. 小RNA分析

　　miRNA鑒定：

　　比對至miRBase數(shù)據(jù)庫(Bowtie2)，定量工具(如miRDeep2)。

　　差異表達(dá)：

　　DESeq2或edgeR篩選差異miRNA(|log2FC|>1，F(xiàn)DR<0.05)。

　　3. mRNA/lncRNA分析

　　拼接與注釋：

　　使用STAR比對，StringTie拼接轉(zhuǎn)錄本，CPC2區(qū)分mRNA與lncRNA。

　　功能富集：

　　GO、KEGG分析(DAVID或clusterProfiler)。

　　4. 生物標(biāo)志物挖掘

　　機(jī)器學(xué)習(xí)建模：

　　隨機(jī)森林(Random Forest)或支持向量機(jī)(SVM)篩選特征RNA組合。

　　ROC曲線評估診斷效能(AUC>0.8為佳)。

　　五、關(guān)鍵挑戰(zhàn)與解決方案

　　六、應(yīng)用案例

　　癌癥早篩：

　　結(jié)直腸癌患者血清中miR-21、miR-92a顯著上調(diào)(AUC=0.89)。

　　病毒感染監(jiān)測：

　　新冠患者血清中宿主基因IFI27、ISG15表達(dá)與病毒載量正相關(guān)。

　　七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

　　防污染：

　　實(shí)驗(yàn)全程佩戴手套、口罩，使用RNase Zap擦拭臺面。

　　單獨(dú)設(shè)置RNA操作區(qū)，避免氣溶膠污染。

　　標(biāo)準(zhǔn)化操作：

　　統(tǒng)一采血至檢測時(shí)間間隔(如<2小時(shí))，減少RNA降解。

　　數(shù)據(jù)公開：

　　原始數(shù)據(jù)上傳至GEO或ENA數(shù)據(jù)庫(遵循FAIR原則)。