外泌體(Exosomes)是直徑約30-150 nm的細(xì)胞外囊泡，攜帶蛋白質(zhì)、核酸等生物活性分子，其濃度測定是研究外泌體功能、疾病標(biāo)志物篩選及藥物遞送系統(tǒng)開發(fā)的關(guān)鍵步驟。以下是常用測定方法及其技術(shù)要點(diǎn)：

　　一、常用測定方法

　　1. 納米顆粒追蹤分析(NTA, Nanoparticle Tracking Analysis)

　　原理：通過激光散射和動態(tài)光散射追蹤顆粒布朗運(yùn)動，計(jì)算粒徑分布與濃度。

　　步驟：

　　外泌體樣本用PBS稀釋至合適濃度(通常10?~10? particles/mL)。

　　注入NTA樣品池，調(diào)整激光強(qiáng)度和攝像參數(shù)。

　　軟件自動分析顆粒運(yùn)動軌跡，生成濃度(particles/mL)和粒徑分布圖。

　　優(yōu)點(diǎn)：直接測定顆粒數(shù)，無需標(biāo)記，可區(qū)分外泌體與其他顆粒。

　　缺點(diǎn)：設(shè)備昂貴，高濃度樣本需稀釋，易受雜質(zhì)(如蛋白質(zhì)聚集體)干擾。

　　2. 可調(diào)電阻脈沖傳感(qNano/TRPS, Tunable Resistive Pulse Sensing)

　　原理：顆粒通過納米孔時引起電阻變化，根據(jù)脈沖信號計(jì)算濃度和粒徑。

　　步驟：

　　選擇合適孔徑的納米孔膜(如NP100對應(yīng)100 nm孔徑)。

　　校準(zhǔn)儀器后注入樣本，調(diào)整壓力使顆粒逐個通過納米孔。

　　分析脈沖信號強(qiáng)度與頻率，獲得濃度數(shù)據(jù)。

　　優(yōu)點(diǎn)：高分辨率(單顆粒水平)，可檢測寬濃度范圍(10?~1012 particles/mL)。

　　缺點(diǎn)：需頻繁校準(zhǔn)，納米孔易堵塞，樣本需嚴(yán)格純化。

　　3. 蛋白質(zhì)定量法(BCA/Bradford法)

　　原理：通過測定外泌體總蛋白含量間接反映濃度。

　　步驟：

　　裂解外泌體(如用RIPA緩沖液)。

　　BCA或Bradford試劑與蛋白反應(yīng)，比色法測定吸光度(562 nm或595 nm)。

　　根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(常用BSA)計(jì)算總蛋白濃度。

　　優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，成本低。

　　缺點(diǎn)：受樣本純度影響大(如游離蛋白污染)，無法區(qū)分外泌體與其他囊泡。

　　4. 流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry)

　　原理：用熒光標(biāo)記外泌體表面標(biāo)志物(如CD63、CD9)，通過流式細(xì)胞儀檢測信號。

　　步驟：

　　外泌體與熒光抗體(如PE-CD63)孵育。

　　使用高靈敏度流式細(xì)胞儀(如Apogee A50)檢測熒光信號。

　　通過微球標(biāo)準(zhǔn)品定量濃度。

　　優(yōu)點(diǎn)：特異性高，可多標(biāo)志物分析。

　　缺點(diǎn)：靈敏度受限(需高表達(dá)標(biāo)志物)，設(shè)備需特殊配置(如小顆粒檢測模塊)。

　　5. ELISA法

　　原理：通過夾心法檢測外泌體特異性蛋白(如TSG101)含量。

　　步驟：

　　包被捕獲抗體(如抗-CD81)于酶標(biāo)板。

　　加入外泌體樣本，孵育后洗滌。

　　加入檢測抗體(如生物素化抗-TSG101)和酶標(biāo)鏈霉親和素，顯色后測定吸光度。

　　優(yōu)點(diǎn)：高特異性，適合臨床樣本。

　　缺點(diǎn)：僅反映蛋白含量，需已知標(biāo)志物，無法直接測定顆粒數(shù)。

　　二、實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵注意事項(xiàng)

　　1. 樣本預(yù)處理

　　純化要求：

　　避免雜質(zhì)干擾：超速離心(100,000×g，2小時)或密度梯度離心去除細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)聚集體。

　　驗(yàn)證純度：透射電鏡(TEM)觀察形態(tài)，Western blot檢測標(biāo)志蛋白(如Alix、HSP70)。

　　保存條件：

　　短期保存：4℃(不超過48小時);長期保存：-80℃(避免反復(fù)凍融)。

　　2. 方法選擇依據(jù)

　　研究目的：

　　顆粒數(shù)測定：優(yōu)先NTA或qNano。

　　蛋白標(biāo)志物分析：選流式或ELISA。

　　樣本類型：

　　高純度樣本(如細(xì)胞上清)：NTA、qNano。

　　復(fù)雜體液(如血漿、尿液)：需結(jié)合純化步驟，推薦ELISA或BCA法。

　　3. 數(shù)據(jù)校正與標(biāo)準(zhǔn)化

　　內(nèi)標(biāo)使用：

　　添加已知濃度的熒光微球(如100 nm聚苯乙烯顆粒)校正儀器誤差。

　　跨平臺驗(yàn)證：

　　聯(lián)合兩種方法(如NTA+BCA)提高結(jié)果可靠性。

　　4. 常見誤差來源

　　外泌體聚集：超聲處理(冰浴，10-30秒)分散顆粒。

　　背景噪音：空白對照(如PBS)扣除非特異性信號。

　　儀器波動：定期校準(zhǔn)設(shè)備，控制室溫(避免溫度漂移)。

　　三、前沿技術(shù)拓展

　　微流控芯片：集成分離與檢測，實(shí)現(xiàn)單外泌體分析(如ExoView平臺)。

　　表面等離子體共振(SPR)：實(shí)時監(jiān)測外泌體結(jié)合事件，動態(tài)分析濃度變化。

　　數(shù)字PCR(dPCR)：通過外泌體攜帶的核酸(如miRNA)拷貝數(shù)定量濃度。

　　四、應(yīng)用場景

　　基礎(chǔ)研究：外泌體分泌機(jī)制、細(xì)胞間通訊。

　　臨床診斷：癌癥、神經(jīng)退行性疾病的外泌體標(biāo)志物篩查。

　　藥物開發(fā)：外泌體載藥系統(tǒng)的載藥量與釋放效率評估。

　　外泌體濃度測定需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、樣本類型及設(shè)備條件選擇合適方法，并嚴(yán)格把控樣本純化和操作標(biāo)準(zhǔn)化。多方法聯(lián)合驗(yàn)證可顯著提升數(shù)據(jù)可信度，為后續(xù)功能研究奠定基礎(chǔ)。