電鏡負(fù)染色技術(shù)是一種用于增強(qiáng)樣品對(duì)比度的透射電子顯微鏡(TEM)樣品制備方法，廣泛應(yīng)用于病毒、蛋白質(zhì)、納米顆粒等生物和材料樣品的觀察。以下是詳細(xì)的技術(shù)步驟和原理：

　　1. 技術(shù)原理

　　負(fù)染色技術(shù)通過在樣品周圍沉積高電子密度的染色劑(如磷鎢酸、醋酸鈾等)，使樣品在透射電鏡下呈現(xiàn)明亮的背景和暗的樣品輪廓，從而增強(qiáng)樣品的對(duì)比度和分辨率。

　　2. 試劑與材料

　　染色劑：

　　磷鎢酸(PTA)：2%水溶液，pH 6.0-7.0。

　　醋酸鈾(UA)：1-2%水溶液，pH 4.5-5.0。

　　甲酸鈾：1-2%水溶液。

　　其他材料：

　　透射電鏡載網(wǎng)(如銅網(wǎng)、金網(wǎng))。

　　支持膜(如碳膜、Formvar膜)。

　　濾紙或吸水紙。

　　微量移液器。

　　3. 實(shí)驗(yàn)步驟

　　3.1 樣品制備

　　樣品稀釋：

　　將待觀察的樣品(如病毒、蛋白質(zhì))用緩沖液(如PBS)適當(dāng)稀釋。

　　支持膜處理：

　　在透射電鏡載網(wǎng)上覆蓋一層支持膜(如碳膜)，確保膜均勻且無破損。

　　3.2 樣品加載

　　用微量移液器取5-10 μL樣品滴加到載網(wǎng)上。

　　靜置1-2分鐘，使樣品吸附在支持膜上。

　　3.3 染色

　　用濾紙吸去多余的樣品液。

　　滴加5-10 μL染色劑(如2%磷鎢酸)到載網(wǎng)上，靜置30秒至1分鐘。

　　用濾紙吸去多余的染色劑，留下薄層染色劑覆蓋樣品。

　　3.4 干燥

　　將載網(wǎng)放置在干燥器中或室溫下自然干燥。

　　確保載網(wǎng)完全干燥后再進(jìn)行電鏡觀察。

　　4. 電鏡觀察

　　將制備好的載網(wǎng)放入透射電鏡樣品桿。

　　在電鏡下觀察樣品，調(diào)整放大倍數(shù)和聚焦，獲得清晰的負(fù)染色圖像。

　　5. 注意事項(xiàng)

　　染色劑選擇：

　　根據(jù)樣品特性選擇合適的染色劑(如磷鎢酸適用于大多數(shù)生物樣品，醋酸鈾適用于核酸樣品)。

　　染色時(shí)間：

　　染色時(shí)間不宜過長，以免染色劑結(jié)晶影響觀察。

　　樣品濃度：

　　樣品濃度過高會(huì)導(dǎo)致堆積，過低則難以觀察，需適當(dāng)稀釋。

　　支持膜質(zhì)量：

　　支持膜應(yīng)均勻無破損，避免影響成像質(zhì)量。

　　操作規(guī)范：

　　染色劑具有毒性，操作時(shí)需佩戴防護(hù)裝備。

　　6. 應(yīng)用

　　負(fù)染色技術(shù)廣泛應(yīng)用于：

　　病毒學(xué)研究：觀察病毒形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

　　蛋白質(zhì)分析：研究蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝和構(gòu)象。

　　納米材料表征：觀察納米顆粒的形貌和分布。

　　細(xì)胞器研究：觀察細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)。

　　7. 優(yōu)缺點(diǎn)

　　優(yōu)點(diǎn)：

　　操作簡單，成本低。

　　可顯著提高樣品對(duì)比度。

　　適用于多種生物和材料樣品。

　　缺點(diǎn)：

　　染色劑可能影響樣品原始結(jié)構(gòu)。

　　對(duì)樣品純度要求較高。

　　無法提供樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的詳細(xì)信息。