BCA法(Bicinchoninic Acid Assay)是一種廣泛使用的蛋白質(zhì)定量方法，適用于多種樣本類型，包括外泌體中的總蛋白濃度測(cè)定。BCA法基于雙縮脲反應(yīng)原理，通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下與Cu2?離子形成絡(luò)合物，隨后這些絡(luò)合物可以還原BCA試劑中的銅離子，生成紫色的復(fù)合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，從而可以通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)量吸光度來(lái)確定蛋白質(zhì)濃度。

　　使用BCA法測(cè)定外泌體中蛋白濃度的步驟

　　1. 樣品準(zhǔn)備

　　外泌體裂解：首先需要將純化后的外泌體制劑進(jìn)行裂解，以釋放出其中的蛋白質(zhì)。通常使用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液(如RIPA緩沖液)，并確保充分混勻。

　　樣品稀釋：為了保證測(cè)量準(zhǔn)確性，可能需要對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專箊終測(cè)得的蛋白質(zhì)濃度落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。

　　2. 制備BCA工作液

　　根據(jù)所選BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)配制BCA工作液。一般情況下，是將BCA試劑A和BCA試劑B按一定比例混合(例如50:1的比例)。某些試劑盒可能已經(jīng)預(yù)混好了這兩種成分。

　　3. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　使用已知濃度的BSA(牛血清白蛋白)作為標(biāo)準(zhǔn)品，制作一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(比如0、25、50、100、200、400 μg/mL等)。

　　向每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品中加入等量的BCA工作液，充分混勻后，在37°C孵育30分鐘至2小時(shí)(具體時(shí)間參照試劑盒說(shuō)明)。

　　孵育完成后，使用分光光度計(jì)在562 nm波長(zhǎng)下讀取各孔的吸光度值。

　　4. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　以BSA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)濃度。

　　5. 結(jié)果計(jì)算

　　將待測(cè)樣品的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣品的實(shí)際蛋白質(zhì)濃度。如果樣品進(jìn)行了稀釋，則需根據(jù)稀釋倍數(shù)調(diào)整z終結(jié)果。

　　注意事項(xiàng)

　　樣品處理：確保外泌體完全裂解，并且避免反復(fù)凍融影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。

　　試劑選擇：選擇適合于微量樣品分析的高靈敏度BCA試劑盒，因?yàn)橥饷隗w中的蛋白質(zhì)含量通常較低。

　　空白對(duì)照：設(shè)置不含蛋白質(zhì)的空白對(duì)照組，用以校正背景吸收。

　　重復(fù)實(shí)驗(yàn)：為了提高數(shù)據(jù)的可靠性，建議每個(gè)樣品至少做三個(gè)技術(shù)重復(fù)。