一、測定原理

　　果膠酯酶催化果膠分子中甲氧基(-OCH?)的水解，生成甲醇和游離羧酸基團(tuán)(果膠酸)?；钚詼y定通過檢測以下任一產(chǎn)物進(jìn)行：

　　甲醇釋放量(分光光度法或HPLC法)。

　　羧酸基團(tuán)生成量(pH滴定法或電導(dǎo)率法)。

　　二、常用測定方法

　　1. 滴定法(羧酸基團(tuán)檢測)

　　原理：果膠酯酶水解果膠產(chǎn)生羧酸，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定反應(yīng)釋放的H?，計(jì)算酶活。

　　適用場景：實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測，無需特殊儀器。

　　試劑配制：

　　底物溶液：1% (w/v) 高甲氧基果膠(HM-pectin)溶于0.1 M NaCl溶液(pH 7.0)。

　　緩沖液：0.1 M檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 4.5~7.5，根據(jù)酶z適pH調(diào)整)。

　　指示劑：0.1%酚酞乙醇溶液。

　　標(biāo)準(zhǔn)NaOH：0.02 M NaOH溶液(需標(biāo)定)。

　　步驟：

　　反應(yīng)體系：

　　試管中加入5 mL底物溶液 + 2 mL緩沖液，37℃預(yù)溫5分鐘。

　　加入1 mL酶液(空白對(duì)照用煮沸滅活的酶液)，立即混勻并計(jì)時(shí)。

　　終止反應(yīng)：10分鐘后加入5 mL沸水浴滅活酶(100℃, 5分鐘)。

　　滴定：冷卻后加入2滴酚酞指示劑，用0.02 M NaOH滴定至粉紅色(pH 8.2)。

　　計(jì)算：

　　V：NaOH消耗體積(mL)

　　CNaOH?：NaOH濃度(mol/L)

　　t：反應(yīng)時(shí)間(分鐘)

　　V酶?：酶液體積(mL)

　　定義：1單位(U)為每分鐘釋放1 μmol羧酸基所需的酶量。

　　2. 分光光度法(甲醇檢測)

　　原理：甲醇與酸性高錳酸鉀氧化生成甲醛，再與Nash試劑(乙酰丙酮-銨鹽)顯色，412 nm測定吸光度。

　　優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，適合微量檢測。

　　試劑配制：

　　Nash試劑：150 g乙酸銨 + 3 mL冰醋酸 + 2 mL乙酰丙酮，定容至1 L(避光保存)。

　　果膠底物：同滴定法。

　　終止液：10% (v/v) 三氯乙酸(TCA)。

　　步驟：

　　反應(yīng)體系：

　　1 mL底物溶液 + 1 mL緩沖液 + 0.5 mL酶液，37℃反應(yīng)30分鐘。

　　加入0.5 mL TCA終止反應(yīng)，離心取上清。

　　顯色反應(yīng)：

　　取0.5 mL上清 + 0.5 mL 0.1%高錳酸鉀(0.1 M H?SO?配制)→ 室溫靜置10分鐘。

　　加入1 mL Nash試劑 → 60℃水浴15分鐘 → 冷卻后412 nm測吸光度。

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線：

　　甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(0~100 μM)同法處理，繪制吸光度-濃度曲線。

　　計(jì)算：

　　C：標(biāo)準(zhǔn)曲線查得甲醇濃度(μmol/mL)

　　V總?：反應(yīng)液總體積(mL)

　　D：稀釋倍數(shù)

　　3. 電導(dǎo)率法(快速檢測)

　　原理：果膠酯酶水解產(chǎn)生羧酸基團(tuán)，溶液電導(dǎo)率升高，通過電導(dǎo)率變化速率計(jì)算酶活。

　　優(yōu)點(diǎn)：實(shí)時(shí)監(jiān)測，無需終止反應(yīng)。

　　步驟：

　　反應(yīng)體系：

　　50 mL燒杯中加入20 mL底物溶液(1%果膠 + 0.1 M NaCl)，恒溫磁力攪拌。

　　插入電導(dǎo)電極，記錄初始電導(dǎo)率(G_0G0?)。

　　啟動(dòng)反應(yīng)：加入1 mL酶液，連續(xù)記錄電導(dǎo)率變化(5分鐘)。

　　計(jì)算：

　　ΔG/Δt：電導(dǎo)率變化率(μS/cm/min)

　　k：校準(zhǔn)系數(shù)(通過標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定確定，通常為1 μS/cm ≈ 0.1 μmol H?)

　　三、注意事項(xiàng)與優(yōu)化

　　底物選擇：

　　使用高甲氧基果膠(甲氧基含量≥50%)，避免低甲氧基果膠干擾。

　　反應(yīng)條件控制：

　　溫度波動(dòng)需<±0.5℃，pH精確校準(zhǔn)(果膠酯酶z適pH通常為4.5~7.5)。

　　干擾排除：

　　避免果膠中殘留的酯酶抑制劑(可預(yù)透析處理底物)。

　　分光光度法中高錳酸鉀需現(xiàn)配現(xiàn)用，防止氧化失效。

　　四、方法對(duì)比

　　五、應(yīng)用實(shí)例

　　食品工業(yè)：監(jiān)測果汁澄清過程中果膠酯酶活性，優(yōu)化酶解條件。

　　植物生理：分析果實(shí)成熟或病原菌侵染時(shí)PME活性變化。