一、實(shí)驗(yàn)原理與目的

　　TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)染色通過(guò)標(biāo)記DNA斷裂的3'-OH末端，特異性檢測(cè)凋亡細(xì)胞。定量分析旨在計(jì)算凋亡細(xì)胞比例或凋亡指數(shù)，用于評(píng)估藥物毒性、疾病模型凋亡程度等。

　　二、圖像采集與預(yù)處理

　　1. 圖像獲取規(guī)范

　　顯微鏡設(shè)置：

　　使用20×或40×物鏡，固定曝光時(shí)間(避免過(guò)曝)。

　　同一實(shí)驗(yàn)組保持相同熒光通道(如FITC：488nm激發(fā)/530nm發(fā)射)。

　　樣本要求：

　　每組至少3張切片，每片隨機(jī)拍攝5-10個(gè)非重疊視野。

　　包含陰性對(duì)照(不加TdT酶)與陽(yáng)性對(duì)照(DNase I處理)。

　　2. 圖像預(yù)處理(ImageJ)

　　拆分通道：Image → Color → Split Channels，保留TUNEL(綠色)與核染色(DAPI，藍(lán)色)。

　　背景扣除：

　　Process → Subtract Background(rolling ball radius=50px)。

　　調(diào)整對(duì)比度：

　　Image → Adjust → Brightness/Contrast(統(tǒng)一所有圖片對(duì)比度范圍)。

　　三、細(xì)胞計(jì)數(shù)與信號(hào)量化

　　1. 核分割(DAPI通道)

　　自動(dòng)計(jì)數(shù)(適用于密集細(xì)胞)：

　　Plugins → Analyze → Cell Counter，手動(dòng)標(biāo)記或自動(dòng)閾值分割：

　　Image → Adjust → Threshold(方法：Otsu，勾選Dark背景)。

　　Analyze → Analyze Particles(Size: 50-Infinity，Circularity: 0.3-1.0)。

　　2. TUNEL陽(yáng)性信號(hào)識(shí)別

　　閾值分割：

　　打開(kāi)TUNEL通道，Image → Adjust → Threshold(建議Huang法，手動(dòng)微調(diào))。

　　勾選Dark background，應(yīng)用閾值生成二值圖像。

　　去除噪聲：

　　Process → Noise → Despeckle(去除孤立噪點(diǎn))。

　　Process → Binary → Watershed(分割粘連信號(hào))。

　　3. 數(shù)據(jù)導(dǎo)出

　　記錄數(shù)值：

　　總細(xì)胞數(shù)(DAPI計(jì)數(shù)) = Count from Analyze Particles。

　　TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) = Count from Threshold后的二值圖像。

　　凋亡率計(jì)算：

　　四、高級(jí)分析技巧

　　1. 共定位分析(TUNEL與特定標(biāo)記)

　　插件：Coloc 2(Fiji)或 JACoP。

　　步驟：

　　對(duì)齊TUNEL與標(biāo)記通道(如Caspase-3)。

　　計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)或Manders重疊系數(shù)。

　　2. 信號(hào)強(qiáng)度量化

　　測(cè)量熒光強(qiáng)度：

　　選中TUNEL陽(yáng)性區(qū)域，Analyze → Measure(記錄Mean Gray Value)。

　　標(biāo)準(zhǔn)化：

　　以陰性對(duì)照平均熒光強(qiáng)度為基線，計(jì)算相對(duì)強(qiáng)度(Fold Change)。

　　五、數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化與統(tǒng)計(jì)

　　歸一化處理：

　　凋亡率 = (實(shí)驗(yàn)組凋亡率 - 陰性對(duì)照凋亡率) / (陽(yáng)性對(duì)照凋亡率 - 陰性對(duì)照凋亡率)。

　　統(tǒng)計(jì)分析：

　　使用GraphPad Prism進(jìn)行ANOVA或t檢驗(yàn)(至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn))。

　　數(shù)據(jù)呈現(xiàn)：柱狀圖(均值±SEM)疊加散點(diǎn)圖。

　　六、注意事項(xiàng)與誤差控制