蛋白抑菌活性測試是評估某種蛋白質(zhì)(如抗菌肽、溶菌酶、防御素、重組蛋白、抗體等)是否具有抑制或殺滅細(xì)菌能力的實(shí)驗(yàn)。該測試廣泛應(yīng)用于新抗菌藥物開發(fā)、免疫學(xué)研究、食品保鮮、生物材料等領(lǐng)域。

　　一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/b>

　　判斷目標(biāo)蛋白是否具有抑菌或殺菌作用;

　　測定其z小抑菌濃度(MIC)和z小殺菌濃度(MBC);

　　比較不同蛋白或處理?xiàng)l件下的抗菌效力;

　　研究作用機(jī)制(如破壞細(xì)胞膜、抑制蛋白合成等)。

　　二、常用抑菌活性檢測方法

　　方法 1：瓊脂擴(kuò)散法(Agar Diffusion Assay)——定性/半定量

　　適用：液體或固體蛋白樣品(如純化蛋白、粗提物)

　　原理：

　　將蛋白樣品加入瓊脂孔中，擴(kuò)散后觀察是否形成抑菌圈。

　　操作步驟：

　　將對數(shù)期生長的指示菌(如大腸桿菌 E. coli、金黃色葡萄球菌 S. aureus)用無菌生理鹽水調(diào)整至 ~10? CFU/mL;

　　取100 μL菌液與4–5 mL溫融的LB瓊脂(約45℃)混合，迅速倒入平皿，制成雙層瓊脂平板;

　　凝固后，用無菌打孔器打孔(直徑6–8 mm)，或放置牛津杯;

　　向孔中加入 50–100 μL 蛋白樣品(不同濃度);

　　37℃ 培養(yǎng) 16–24 小時(shí);

　　測量抑菌圈直徑(含孔徑)，判斷活性。

　　結(jié)果判定：

　　抑菌圈直徑 > 8–10 mm：有抑菌活性

　　越大表示活性越強(qiáng)

　　可設(shè)置陽性對照(如氨芐青霉素)和陰性對照(緩沖液)

　　注意：蛋白在瓊脂中擴(kuò)散能力受分子量影響，大分子蛋白擴(kuò)散慢，抑菌圈可能較小。

　　方法 2：液體稀釋法(Broth Dilution Assay)——定量(推薦)

　　目的：測定z小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)

　　原理：

　　在液體培養(yǎng)基中對蛋白進(jìn)行倍比稀釋，加入細(xì)菌，觀察是否抑制生長。

　　操作步驟(96孔板法)：

　　在96孔板中，用LB或MHB培養(yǎng)基對蛋白進(jìn)行倍比稀釋(如 256 → 128 → 64 → ... → 0 μg/mL);

　　每孔加入菌液，使終濃度為 ~10? CFU/mL;

　　設(shè)：

　　陰性對照：菌 + 培養(yǎng)基(應(yīng)生長)

　　陽性對照：菌 + 抗生素(應(yīng)無生長)

　　樣品對照：蛋白 + 培養(yǎng)基(無菌，排除污染)

　　37℃ 靜置培養(yǎng) 16–24 小時(shí);

　　觀察各孔是否渾濁(細(xì)菌生長);

　　完全無渾濁的z低蛋白濃度即為 MIC。

　　方法 3：z小殺菌濃度(Minimum Bactericidal Concentration, MBC)

　　目的：判斷蛋白是抑菌還是殺菌

　　操作：

　　取 MIC 及以上濃度的無菌生長孔，取100 μL涂布于LB平板;

　　37℃ 培養(yǎng) 24 小時(shí);

　　統(tǒng)計(jì)菌落數(shù);

　　殺死 ≥99.9% 細(xì)菌的z低濃度為 MBC。

　　 判斷標(biāo)準(zhǔn)：

　　若 MBC ≤ 4×MIC：認(rèn)為是殺菌劑(bactericidal)

　　若 MBC > 4×MIC：認(rèn)為是抑菌劑(bacteriostatic)

　　方法 4：時(shí)間-殺菌曲線(Time-kill Assay)

　　目的：動態(tài)觀察蛋白的殺菌動力學(xué)

　　操作：

　　將細(xì)菌與不同濃度蛋白(如 MIC、2×MIC、4×MIC)共孵育;

　　在不同時(shí)間點(diǎn)(0、1、2、4、6、8、24 h)取樣;

　　梯度稀釋后涂板;

　　培養(yǎng)后計(jì)數(shù)菌落(CFU/mL);

　　繪制“時(shí)間-活菌數(shù)”曲線。

　　結(jié)果：

　　曲線快速下降 → 殺菌作用強(qiáng)

　　曲線平臺期 → 抑菌作用

　　方法 5：細(xì)胞膜通透性檢測(機(jī)制研究)

　　原理：

　　許多抗菌蛋白通過破壞細(xì)胞膜起作用。

　　常用方法：

　　SYTOX Green 染色：該染料不能穿透完整膜，但可進(jìn)入膜破損細(xì)胞并發(fā)光;

　　用熒光酶標(biāo)儀檢測熒光增強(qiáng)，反映膜通透性變化;

　　掃描電鏡(SEM)或透射電鏡(TEM)：觀察細(xì)胞形態(tài)損傷;

　　β-半乳糖苷酶釋放實(shí)驗(yàn)：檢測細(xì)胞內(nèi)酶泄漏。