動(dòng)物組織的透射電鏡(Transmission Electron Microscopy, TEM) 是研究細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的強(qiáng)有力工具，能夠以納米級(jí)分辨率觀察細(xì)胞器、生物大分子、病毒、細(xì)胞骨架、膜系統(tǒng)等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、病理學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、免疫學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域。

　　一、透射電鏡原理簡(jiǎn)述

　　原理：高能電子束穿透超薄組織切片(50–100 nm)，電子與樣品中的原子相互作用，發(fā)生散射，未散射或散射角度小的電子通過(guò)物鏡形成明場(chǎng)像，z終在熒光屏或CCD相機(jī)上成像。

　　分辨率：可達(dá) 0.1–0.3 nm，遠(yuǎn)高于光學(xué)顯微鏡(~200 nm)。

　　放大倍數(shù)：可達(dá) 數(shù)十萬(wàn)倍至百萬(wàn)倍。

　　二、動(dòng)物組織透射電鏡制樣流程(關(guān)鍵步驟)

　　由于電子束穿透力有限且樣品必須在高真空中觀察，樣品制備是TEM成功的關(guān)鍵。流程如下：

　　1. 取材(Fixation)

　　快速取材：動(dòng)物處死后立即取組織(如肝、腎、腦、心肌等)，時(shí)間越短越好(<1分鐘)，防止自溶。

　　大小控制：切成 1 mm3 左右的小塊(邊長(zhǎng)≤1 mm)，確保固定液充分滲透。

　　2. 初固定(Primary Fixation)

　　常用固定液：2.5% 戊二醛(Glutaraldehyde) 溶于0.1 M 磷酸緩沖液(pH 7.2–7.4)

　　溫度：4℃(冰箱中進(jìn)行)

　　時(shí)間：1–2小時(shí)(小組織)至 數(shù)小時(shí)(大組織)

　　目的：交聯(lián)蛋白質(zhì)，保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定

　　注意：戊二醛固定效果好，但可能掩蓋抗原性(如后續(xù)做免疫電鏡需注意)

　　3. 清洗(Rinse)

　　用 0.1 M 磷酸緩沖液 漂洗 3 次，每次 10–15 分鐘

　　去除殘留戊二醛，防止與后續(xù)試劑反應(yīng)

　　4. 后固定(Post-fixation)

　　常用固定液：1% 鋨酸(Osmium tetroxide, OsO?)

　　溫度：4℃

　　時(shí)間：1–2 小時(shí)

　　目的：

　　固定脂質(zhì)(如細(xì)胞膜、線粒體膜)

　　增加電子密度，增強(qiáng)對(duì)比度

　　穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)

　　注意：鋨酸劇毒、易揮發(fā)，必須在通風(fēng)櫥中操作，避免光照

　　5. 脫水(Dehydration)

　　使用梯度乙醇或丙酮脫水：

　　50% → 70% → 80% → 90% → 95% → 100% × 3 次

　　每步 10–15 分鐘

　　目的：去除水分，為樹(shù)脂滲透做準(zhǔn)備

　　6. 滲透(Infiltration)

　　使用環(huán)氧樹(shù)脂(如 Epon 812、Araldite)或LR White(水溶性樹(shù)脂，適合免疫電鏡)

　　梯度滲透：樹(shù)脂:丙酮 = 1:3 → 1:1 → 3:1 → 純樹(shù)脂 × 2–3 次

　　每步 1–2 小時(shí)，4℃或室溫

　　7. 包埋(Embedding)

　　將組織轉(zhuǎn)入包埋模具，加入新鮮樹(shù)脂

　　60–70℃ 烘箱中聚合 24–48 小時(shí)，形成堅(jiān)硬樹(shù)脂塊

　　8. 超薄切片(Ultramicrotomy)

　　使用超薄切片機(jī)(Ultramicrotome)和金剛石刀

　　切片厚度：50–100 nm

　　收集切片于銅網(wǎng)(如200目銅網(wǎng))上

　　9. 染色(Staining)

　　增強(qiáng)電子對(duì)比度：

　　醋酸雙氧鈾(Uranyl acetate)：染核酸、蛋白質(zhì)，50%甲醇溶液，避光染色 15–30 分鐘

　　檸檬酸鉛(Lead citrate)：染膜結(jié)構(gòu)，染色 5–10 分鐘(需避CO?，防止碳酸鉛沉淀)

　　醋酸雙氧鈾弱放射性，檸檬酸鉛有毒，操作需戴手套，在通風(fēng)處進(jìn)行

　　10. 透射電鏡觀察

　　將銅網(wǎng)放入電鏡樣品臺(tái)

　　在 60–120 kV 電壓下觀察

　　調(diào)整聚焦、對(duì)比度、放大倍數(shù)(常用 5,000× – 100,000×)

　　拍攝圖像(數(shù)字相機(jī)或底片)

　　三、典型動(dòng)物組織超微結(jié)構(gòu)識(shí)別

　　四、特殊技術(shù)(進(jìn)階應(yīng)用)

　　1. 免疫電鏡(Immuno-TEM)

　　用膠體金標(biāo)記抗體，定位特定抗原

　　可在超薄切片上進(jìn)行(Post-embedding)或在包埋前(Pre-embedding)

　　2. 負(fù)染色(Negative Staining)

　　用于病毒、蛋白質(zhì)復(fù)合物、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)

　　常用染液：磷鎢酸(PTA)、醋酸雙氧鈾

　　3. 電鏡原位雜交(EM-ISH)

　　結(jié)合核酸探針與金標(biāo)抗體，定位特定RNA/DNA