在進(jìn)行組織石蠟切片的免疫熒光雙染實驗時，關(guān)鍵在于確保抗原表位的充分暴露以及避免交叉反應(yīng)。下面是進(jìn)行這種復(fù)雜實驗的一般步驟和注意事項：

　　實驗準(zhǔn)備

　　材料準(zhǔn)備：包括高質(zhì)量的石蠟切片、一抗(針對兩種不同目標(biāo)蛋白)、熒光標(biāo)記二抗(每種一抗對應(yīng)一個特定的熒光標(biāo)記)、封片劑、PBS緩沖液等。

　　設(shè)備準(zhǔn)備：需要顯微鏡、孵育盒、水浴鍋、脫蠟用的二甲苯或替代品、酒精梯度等。

　　實驗步驟

　　脫蠟與再水化：

　　使用二甲苯或其環(huán)保替代品去除石蠟，然后通過一系列濃度遞減的乙醇溶液將樣本逐步水化至純水。

　　抗原修復(fù)：

　　由于石蠟處理過程可能導(dǎo)致抗原表位被遮蔽，通常需要進(jìn)行抗原修復(fù)以恢復(fù)抗原性。常用的方法有熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)(HIER)和酶誘導(dǎo)抗原修復(fù)(PIER)，根據(jù)所使用的抗體說明書選擇合適的方式。

　　封閉非特異性結(jié)合位點：

　　使用血清或其他封閉劑處理切片，以減少背景信號和非特異性結(jié)合。

　　第一輪免疫染色：

　　滴加第一種一抗，置于濕盒中，在適宜溫度下孵育過夜。

　　清洗后，加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗，再次孵育適當(dāng)時間。

　　再次清洗。

　　第二輪免疫染色：

　　如果兩種一抗來源于不同物種，則可以直接進(jìn)行第二種一抗的孵育;如果來源相同，則需考慮使用不同的策略如使用不同類型的檢測系統(tǒng)或分步操作來避免交叉反應(yīng)。

　　孵育第二種一抗后，清洗并加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗。

　　復(fù)染與封片：

　　可以選擇性地使用DAPI等核染料進(jìn)行復(fù)染，以便于觀察細(xì)胞核位置。

　　z后，使用含有抗淬滅劑的封片劑封片。

　　成像分析：

　　利用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡對樣品進(jìn)行成像，并利用圖像分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

　　注意事項

　　抗體兼容性：確保兩種一抗分別來自不同的宿主動物，以避免交叉反應(yīng)。

　　熒光染料選擇：選用發(fā)射波長不同的熒光染料，以便于區(qū)分兩個目標(biāo)分子。

　　優(yōu)化條件：可能需要對每個抗體的濃度、孵育時間和溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得z佳的信噪比。

　　防止光漂白：在處理和成像過程中采取措施防止熒光信號減弱。