CHO(Chinese Hamster Ovary，中國(guó)倉鼠卵巢)細(xì)胞是一種常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，廣泛應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域，尤其是在重組蛋白的生產(chǎn)中。構(gòu)建CHO穩(wěn)定株是指通過將特定的外源基因?qū)隒HO細(xì)胞，并篩選出能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)該基因產(chǎn)物的細(xì)胞克隆。下面是CHO穩(wěn)定株構(gòu)建的一般步驟：

　　1. 載體設(shè)計(jì)與準(zhǔn)備

　　選擇合適的載體：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適合的表達(dá)載體，通常包括強(qiáng)啟動(dòng)子(如CMV、EF1α)、多克隆位點(diǎn)、抗性基因(用于后續(xù)篩選)等元件。

　　插入目標(biāo)基因：使用限制性內(nèi)切酶或PCR擴(kuò)增的方法將目標(biāo)基因插入到載體中，確保正確的讀碼框和必要的調(diào)控序列。

　　2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

　　選擇轉(zhuǎn)染方法：可以采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、電穿孔法或其他適合于CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染技術(shù)。

　　優(yōu)化條件：不同的轉(zhuǎn)染方法可能需要優(yōu)化參數(shù)以提高轉(zhuǎn)染效率，例如DNA與轉(zhuǎn)染試劑的比例、孵育時(shí)間等。

　　3. 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞

　　藥物篩選：利用載體上攜帶的抗性基因(如G418、嘌呤霉素)，在轉(zhuǎn)染后加入相應(yīng)的藥物來殺死未成功轉(zhuǎn)入載體的細(xì)胞，留下具有抗性的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

　　單克隆化：為了獲得表達(dá)水平一致且穩(wěn)定的細(xì)胞株，常采用有限稀釋法或FACS(熒光激活細(xì)胞排序)從群體中分離單個(gè)細(xì)胞，形成單克隆。

　　4. 表達(dá)驗(yàn)證

　　檢測(cè)表達(dá)水平：通過Western blot、ELISA等方法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況，確定各克隆間的差異。

　　穩(wěn)定性測(cè)試：長(zhǎng)期培養(yǎng)選定的克隆，定期檢查其表達(dá)穩(wěn)定性，確保即使經(jīng)過多次傳代后仍能保持高水平的目標(biāo)蛋白表達(dá)。

　　5. 擴(kuò)大培養(yǎng)與生產(chǎn)

　　一旦確認(rèn)了高產(chǎn)且穩(wěn)定的CHO細(xì)胞株，就可以進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，用于生產(chǎn)所需的重組蛋白。