Ki-67是一種在細(xì)胞增殖過(guò)程中表達(dá)的蛋白質(zhì)，它出現(xiàn)在除了G0期(靜止期)之外的所有細(xì)胞周期階段(G1、S、G2和M期)。因此，Ki-67常被用作細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，廣泛應(yīng)用于腫瘤生物學(xué)研究、病理診斷以及評(píng)估治療反應(yīng)等領(lǐng)域。檢測(cè)Ki-67表達(dá)水平可以幫助了解細(xì)胞群體的增殖活性。

　　Ki-67細(xì)胞增殖檢測(cè)方法

　　1. 免疫組織化學(xué)染色(IHC, Immunohistochemistry)

　　原理：利用針對(duì)Ki-67抗原的特異性抗體對(duì)固定后的組織切片或細(xì)胞涂片進(jìn)行染色。

　　操作步驟：

　　樣本準(zhǔn)備：制備石蠟包埋的組織切片或細(xì)胞涂片，并進(jìn)行脫蠟處理。

　　抗原修復(fù)：由于固定過(guò)程可能會(huì)掩蓋抗原決定簇，通常需要通過(guò)加熱或酶消化來(lái)進(jìn)行抗原修復(fù)。

　　阻斷非特異性結(jié)合：使用血清或其他封閉劑減少背景染色。

　　一抗孵育：加入Ki-67抗體，讓其與樣品中的Ki-67蛋白結(jié)合。

　　二抗孵育：使用標(biāo)記了酶(如HRP)或熒光基團(tuán)的二抗來(lái)放大信號(hào)。

　　顯色/熒光檢測(cè)：如果使用的是酶標(biāo)二抗，則需添加相應(yīng)的底物(如DAB)產(chǎn)生顏色反應(yīng);如果是熒光標(biāo)記，則直接在熒光顯微鏡下觀(guān)察。

　　結(jié)果分析：計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例(Ki-67指數(shù))，這可以手動(dòng)完成，也可以借助圖像分析軟件自動(dòng)計(jì)數(shù)。

　　2. 流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry)

　　原理：基于流式細(xì)胞儀快速分析單個(gè)細(xì)胞上的熒光標(biāo)記情況，適用于懸浮細(xì)胞或從組織中分離出來(lái)的單細(xì)胞懸液。

　　操作步驟：

　　細(xì)胞準(zhǔn)備：收集并固定細(xì)胞，必要時(shí)進(jìn)行通透化處理以便抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

　　染色：用Ki-67抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。

　　數(shù)據(jù)分析：通過(guò)流式細(xì)胞儀獲取數(shù)據(jù)，根據(jù)熒光強(qiáng)度區(qū)分陽(yáng)性細(xì)胞和陰性細(xì)胞，從而確定Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞的比例。

　　3. Western Blot

　　原理：用于檢測(cè)細(xì)胞或組織提取物中的Ki-67蛋白水平，雖然不能直接給出增殖比例，但能提供關(guān)于Ki-67存在與否及其相對(duì)量的信息。

　　操作步驟：包括蛋白質(zhì)提取、電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育及化學(xué)發(fā)光成像等步驟。

　　應(yīng)用領(lǐng)域

　　腫瘤學(xué)研究：Ki-67指數(shù)是評(píng)估腫瘤惡性程度的重要指標(biāo)之一，高Ki-67指數(shù)往往提示更差的預(yù)后。

　　藥物療效評(píng)價(jià)：在臨床試驗(yàn)中，監(jiān)測(cè)Ki-67的變化可用于評(píng)估抗癌藥物的效果。

　　基礎(chǔ)科學(xué)研究：幫助理解正常生理狀態(tài)下細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)制。