定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction, qPCR)是一種用于檢測和量化DNA或RNA分子數(shù)量的強(qiáng)大技術(shù)。當(dāng)應(yīng)用于RNA時(shí)，通常首先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后通過qPCR對目標(biāo)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，這種方法稱為反轉(zhuǎn)錄qPCR(RT-qPCR)。以下是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄qPCR測定的基本步驟和技術(shù)要點(diǎn)：

　　實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

　　1. 樣品收集與處理

　　樣品采集：根據(jù)研究目的選擇合適的組織、細(xì)胞或液體樣本。

　　RNA提?。菏褂眠m當(dāng)?shù)脑噭┖谢蚍椒?如TRIzol法、柱純化法等)從樣本中提取總RNA，并確保RNA的質(zhì)量和完整性。

　　2. RNA質(zhì)量評估

　　使用分光光度計(jì)(如NanoDrop)測量RNA濃度和純度(A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間)。

　　通過瓊脂糖凝膠電泳或生物分析儀檢查RNA完整性。

　　反轉(zhuǎn)錄過程

　　1. cDNA合成

　　使用逆轉(zhuǎn)錄酶(如M-MLV或AMV)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA?？梢圆捎胦ligo(dT)引物特異性地反轉(zhuǎn)錄poly(A)尾的mRNA，或者使用隨機(jī)六聚體引物來覆蓋更廣泛的RNA序列。

　　qPCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

　　1. 引物設(shè)計(jì)

　　設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高的引物對目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增。理想情況下，引物長度應(yīng)在18-25bp之間，GC含量約為40%-60%，并且避免形成二級結(jié)構(gòu)。

　　對于每個(gè)目標(biāo)基因，建議同時(shí)設(shè)計(jì)一對內(nèi)參基因(如GAPDH、β-actin等)用于數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。

　　2. qPCR反應(yīng)體系構(gòu)建

　　準(zhǔn)備含有SYBR Green I或其他熒光染料的預(yù)混液，加入適量的cDNA模板、上下游引物及無核酸酶水至推薦體積。

　　每個(gè)樣本至少設(shè)置三個(gè)技術(shù)重復(fù)以減少實(shí)驗(yàn)誤差。

　　qPCR運(yùn)行與數(shù)據(jù)分析

　　1. 程序設(shè)置

　　根據(jù)所使用的qPCR儀器說明書設(shè)定熱循環(huán)條件，一般包括預(yù)變性(95°C, 10分鐘)，隨后是多個(gè)循環(huán)(如40次)的變性(95°C, 15秒)、退火(60°C左右, 30秒)及延伸(72°C, 30秒)階段。

　　在每次循環(huán)后收集熒光信號以監(jiān)測產(chǎn)物積累情況。

　　2. 數(shù)據(jù)分析

　　利用Ct值(Cycle threshold)比較不同樣本間目標(biāo)基因的相對表達(dá)量。ΔΔCt法是常用的相對定量方法之一，通過計(jì)算目標(biāo)基因相對于內(nèi)參基因的ΔCt值差異來進(jìn)行歸一化處理。

　　如果需要絕對定量，則可以通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定未知樣品中的基因拷貝數(shù)。

　　注意事項(xiàng)

　　在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格控制污染，尤其是防止外源性DNA污染影響結(jié)果準(zhǔn)確性。

　　定期校準(zhǔn)儀器并使用高質(zhì)量的試劑有助于提高實(shí)驗(yàn)的可靠性和重現(xiàn)性。

　　考慮到生物變異，z好在不同條件下多次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證結(jié)論的有效性。