免疫印跡(Western Blot，WB)是一種廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)，主要用于檢測細(xì)胞或組織樣品中特定蛋白質(zhì)的存在、相對數(shù)量及分子量。該方法結(jié)合了凝膠電泳分離蛋白質(zhì)與特異性抗體識別目標(biāo)蛋白的優(yōu)點(diǎn)，是研究蛋白質(zhì)表達(dá)水平、翻譯后修飾狀態(tài)以及相互作用等的重要工具。

　　免疫印跡測試的基本步驟

　　樣品準(zhǔn)備

　　收集細(xì)胞或組織樣本，并使用適當(dāng)?shù)牧呀饩彌_液將其溶解以釋放蛋白質(zhì)。

　　對樣品進(jìn)行定量，確保每孔上樣量一致，以便于比較不同樣品間的蛋白質(zhì)表達(dá)差異。

　　SDS-PAGE電泳

　　將蛋白質(zhì)樣品加入含有十二烷基硫酸鈉(SDS)的聚丙烯酰胺凝膠中，通過電場作用使蛋白質(zhì)按照其分子大小遷移。

　　一般情況下，較大分子量的蛋白質(zhì)遷移速度較慢，較小分子量的蛋白質(zhì)則較快穿過凝膠。

　　轉(zhuǎn)膜

　　在電泳完成后，將分離后的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物(如硝酸纖維素膜或PVDF膜)上。

　　這一過程通常通過電轉(zhuǎn)移完成，也可以采用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法。

　　封閉

　　為了減少非特異性結(jié)合，需用含脫脂奶粉或BSA的緩沖液封閉膜上的未結(jié)合位點(diǎn)。

　　一抗孵育

　　使用針對目標(biāo)蛋白的一級抗體與膜上的蛋白質(zhì)結(jié)合。選擇合適的一抗是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，它決定了特異性和靈敏度。

　　洗滌

　　徹底清洗膜以去除未結(jié)合的一抗，防止背景噪音增加。

　　二抗孵育

　　加入標(biāo)記有酶(如辣根過氧化物酶HRP或堿性磷酸酶AP)或熒光標(biāo)簽的二級抗體，用于放大信號。

　　顯色/發(fā)光

　　根據(jù)所使用的標(biāo)記物類型選擇相應(yīng)的底物進(jìn)行反應(yīng)。例如，HRP標(biāo)記的二抗可與DAB或ECL試劑發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在X光片上形成圖像;熒光標(biāo)記則可通過激光掃描儀直接讀取信號強(qiáng)度。

　　數(shù)據(jù)分析

　　分析結(jié)果圖像，確定目標(biāo)蛋白條帶的位置及其灰度值或發(fā)光強(qiáng)度，以此評估目標(biāo)蛋白在各組樣品中的表達(dá)水平。

　　注意事項(xiàng)

　　樣品處理：保持樣品新鮮并盡量避免反復(fù)凍融，以免影響蛋白質(zhì)活性。

　　內(nèi)參選擇：為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，常選用β-actin、GAPDH等作為內(nèi)參來校正上樣量差異。

　　抗體選擇：根據(jù)物種來源、抗原決定簇位置等因素謹(jǐn)慎挑選適合的一抗和二抗。

　　優(yōu)化條件：對于不同的蛋白質(zhì)，可能需要調(diào)整電泳時(shí)間、電壓，轉(zhuǎn)膜效率，封閉時(shí)間和濃度，抗體稀釋比例等參數(shù)。