Ki67是一種核蛋白，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)(存在于G1、S、G2和M期，靜止期G0細(xì)胞不表達(dá))，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Ki67陽(yáng)性細(xì)胞比例可量化細(xì)胞增殖活性。

　　一、實(shí)驗(yàn)流程概述

　　樣本準(zhǔn)備 → 固定 → 透膜 → 抗體染色 → 流式檢測(cè) → 數(shù)據(jù)分析

　　二、詳細(xì)操作步驟

　　1. 樣本制備

　　細(xì)胞類(lèi)型：懸浮細(xì)胞直接收集;貼壁細(xì)胞需胰酶消化(避免過(guò)度消化損傷膜表面蛋白)。

　　細(xì)胞數(shù)量：建議每樣本≥1×10?細(xì)胞，確保統(tǒng)計(jì)學(xué)可靠性。

　　對(duì)照組設(shè)置：

　　陰性對(duì)照：同型IgG抗體(匹配Ki67抗體種屬和亞型);

　　陽(yáng)性對(duì)照：已知高增殖細(xì)胞(如激活的淋巴細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞系)。

　　2. 固定與透膜

　　乙醇固定可同時(shí)透膜，若使用PFA需額外透膜處理;

　　透膜時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致細(xì)胞碎片增多，需優(yōu)化。

　　3. 抗體染色

　　抗體選擇：

　　推薦抗人Ki67抗體(如BD Pharmingen 克隆B56，適用種屬：人、猴);

　　種屬匹配二抗(如兔抗小鼠IgG-Alexa Fluor 488)。

　　染色步驟：

　　封閉：1% BSA/PBS，室溫30分鐘(減少非特異性結(jié)合);

　　一抗孵育：Ki67抗體(稀釋比例1:100~1:200)，4℃避光1小時(shí);

　　洗滌：PBS洗3次，離心300g×5分鐘;

　　二抗孵育(間接法需此步)：避光室溫30分鐘;

　　再次洗滌，重懸于PBS(含1% BSA)。

　　4. 流式檢測(cè)

　　儀器設(shè)置：

　　激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)：根據(jù)熒光染料選擇(如Alexa Fluor 488→Ex 488 nm/Em 530 nm);

　　閾值設(shè)定：FSC/SSC排除碎片，調(diào)節(jié)電壓使陰性群位于101~102通道。

　　數(shù)據(jù)采集：收集≥10,000個(gè)細(xì)胞事件，保存FCS格式文件。

　　5. 數(shù)據(jù)分析

　　軟件：FlowJo、FCS Express或BD FACSDiva。

　　門(mén)控策略：

　　FSC-A vs SSC-A：圈定活細(xì)胞群，排除碎片;

　　單細(xì)胞門(mén)：FSC-H vs FSC-A去除粘連體;

　　熒光通道：對(duì)比陰性對(duì)照，設(shè)門(mén)區(qū)分Ki67?(增殖細(xì)胞)與Ki67?(靜止細(xì)胞)。

　　結(jié)果輸出：Ki67陽(yáng)性細(xì)胞百分比(%)、平均熒光強(qiáng)度(MFI)。

　　三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)與優(yōu)化

　　1. 避免假陽(yáng)性/假陰性

　　2. 多色Panel設(shè)計(jì)

　　兼容標(biāo)記：

　　細(xì)胞周期：與DNA染料(如PI、7-AAD)聯(lián)用，需先固定透膜后染色;

　　表面標(biāo)記：先染表面抗原(如CD3/CD19)，再固定透膜染Ki67;

　　凋亡檢測(cè)：避免與Annexin V(需完整膜結(jié)構(gòu))同時(shí)使用。

　　3. 特殊樣本處理

　　組織樣本：

　　制備單細(xì)胞懸液(機(jī)械分散+膠原酶消化);

　　紅細(xì)胞裂解(ACK緩沖液：155 mM NH?Cl, 10 mM KHCO?, 0.1 mM EDTA)。

　　冰凍細(xì)胞：固定后可用含10% DMSO的凍存液-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

　　四、應(yīng)用場(chǎng)景與數(shù)據(jù)解讀

　　腫瘤研究：Ki67?比例>20%提示高增殖性(如侵襲性淋巴瘤);

　　免疫學(xué)：評(píng)估T/B細(xì)胞活化狀態(tài)(如疫苗免疫后增殖水平);

　　藥物篩選：對(duì)比處理組與對(duì)照組Ki67?比例，計(jì)算抑制率。

　　五、常見(jiàn)問(wèn)題FAQ

　　Q1: Ki67與BrdU檢測(cè)有何區(qū)別?

　　Ki67：標(biāo)記所有活躍周期細(xì)胞(無(wú)需預(yù)標(biāo)記);

　　BrdU：需細(xì)胞攝入胸腺嘧啶類(lèi)似物，僅標(biāo)記S期細(xì)胞。

　　Q2: 能否與細(xì)胞活力染料(如PI)聯(lián)用?

　　可以，但需注意PI與紅色熒光通道沖突(建議選用綠色Ki67抗體+PI在FL2/FL3檢測(cè))。

　　Q3: 乙醇固定后細(xì)胞形態(tài)變化影響FSC/SSC?

　　是，乙醇固定會(huì)縮小細(xì)胞體積(FSC降低)，需重新調(diào)整電壓和閾值。