1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)關(guān)鍵步驟

　　細(xì)胞刺激與阻斷：

　　使用布雷菲德菌素A(BFA)或莫能菌素抑z細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)胞內(nèi)累積。

　　抗原特異性刺激：HIV Gag肽庫(kù)(5 μg/mL)激活CD8+ T細(xì)胞。

　　細(xì)胞表面染色：標(biāo)記CD3、CD4、CD8等表型抗體(避光，4℃孵育30分鐘)。

　　固定與破膜：

　　固定液(4%多聚甲醛)維持細(xì)胞形態(tài)。

　　破膜劑(0.1% Triton X-100或商品化試劑盒)穿透細(xì)胞膜。

　　胞內(nèi)染色：加入IFN-γ、IL-2等熒光標(biāo)記抗體(室溫避光孵育1小時(shí))。

　　2. 流式細(xì)胞術(shù)參數(shù)設(shè)置

　　電壓與補(bǔ)償：?jiǎn)侮?yáng)對(duì)照調(diào)節(jié)PMT電壓，補(bǔ)償矩陣消除熒光溢出。

　　設(shè)門策略：

　　排除死細(xì)胞(DAPI或Fixable Viability Dye)。

　　圈選CD3+CD4+或CD3+CD8+群體，分析細(xì)胞因子雙陽(yáng)性細(xì)胞比例。