一、紫外分光光度法(推薦方法)

　　1、實驗原理

　　CAT催化H?O?分解，導致其在240nm處吸光度下降，通過測定吸光值變化速率計算酶活性。

　　2、試劑準備

　　50mM PBS緩沖液(pH7.0)

　　30mM H?O?(現(xiàn)配現(xiàn)用)

　　酶提取液(含1mM EDTA的PBS)

　　3、操作步驟

　　樣品處理：

　　取0.2g樣品液氮研磨

　　加入2mL預冷提取液

　　4℃ 12,000g離心15min

　　上清液為酶提取液

　　反應體系(1mL)：

　　3、測定：

　　立即混勻

　　240nm處每30s記錄吸光值

　　連續(xù)測定3min

　　數(shù)據(jù)處理

　　CAT活性(U/gFW)=ΔA240×V總/(ε×d×m×V酶)

　　其中：

　　ΔA240：每分鐘吸光度變化值

　　ε=40M?1cm?1(H?O?摩爾消光系數(shù))

　　d=1cm(比色皿光徑)

　　m=樣品鮮重(g)

　　V總=1mL

　　V酶=20μL

　　二、高錳酸鉀滴定法

　　實驗流程

　　1、反應體系：

　　5mL 0.1M H?O?

　　1mL酶液

　　25℃反應5min

　　2、終止反應：

　　加入5mL 10% H?SO?

　　3、滴定：

　　用0.01M KMnO?滴定至淡粉色

　　結(jié)果計算

　　CAT活性(U/g)=(V空白-V樣品)×C×5/(t×m)

　　C：KMnO?濃度(mol/L)

　　t：反應時間(min)

　　三、氧電極法

　　操作要點

　　1、儀器校準：

　　無氧水(Na?SO?飽和)

　　空氣飽和水

　　2、反應體系(2mL)：

　　PBS緩沖液

　　20μL酶液

　　20μL 30mM H?O?

　　結(jié)果計算

　　CAT活性(U/g)=Δ[O?]×V/m

　　四、注意事項

　　1、關(guān)鍵控制點：

　　H?O?需現(xiàn)配現(xiàn)用

　　酶提取全程保持4℃

　　反應溫度控制在25±0.5℃

　　2、常見問題：

　　吸光度變化不明顯：可適當增加酶液用量

　　反應速度過快：稀釋酶液或降低H?O?濃度

　　3、方法選擇建議：

　　五、應用實例

　　以小麥葉片CAT測定為例：

　　取樣：取第3片完全展開葉

　　提?。喊?:10(w/v)加入提取液

　　測定：紫外分光光度法

　　典型結(jié)果：

　　正常生長：15-20U/gFW

　　干旱脅迫：25-35U/gFW

　　注：1U定義為每分鐘分解1μmol H?O?所需的酶量。建議每個樣品設(shè)置3次重復，數(shù)據(jù)取平均值±標準差。