a. 抗體孵育時(shí)間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條;

　　b. 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看;

　　c. 內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細(xì)胞多的組織)，需要通過延長滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色;

　　d. 非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果;

　　e. DAB孵育時(shí)間過長或濃度過高;

　　f. PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要;

　　g. 標(biāo)本染色過長中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。