外泌體NTA結(jié)果怎么看?外泌體參與神經(jīng)疾病和癌癥等很多種疾病的病理過程，同時在正常的生理過程中也發(fā)揮著介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的重要功能。細(xì)胞外囊泡在臨床醫(yī)學(xué)中也有十分光明的應(yīng)用前景，由于它們含有豐富的生物標(biāo)志物，可用于監(jiān)測疾病進(jìn)展，治療反應(yīng)等，同時由于外泌體具有攜帶遞送生物分子的功能，具有成為臨床藥物遞送載體的潛力。外泌體的功能研究一步，即進(jìn)行外泌體的鑒定。

　　外泌體是由細(xì)胞分泌的直徑在30~150nm的膜性小囊泡，那么是否存在直徑大于150nm或與外泌體大小相近的其它膜性小囊泡呢?答案是肯定的。這里就要說到細(xì)胞外囊泡(EVs)，EVs是由細(xì)胞釋放的膜性小囊泡，直徑在30nm到9μm之間，根據(jù)直徑的大小，可細(xì)分為三大類：外泌體(30~150nm)、微囊泡(100-1000nm)和凋亡小體(50-2000nm)。

　　國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(ISEV)在2014年提議，對于分離獲得的外泌體需要從三個層面進(jìn)行鑒定：(1)Western Blot(WB)鑒定外泌體表面標(biāo)志物;(2)透射電鏡(TEM)鑒定外泌體形態(tài);(3)粒徑分析(NTA)鑒定外泌體大小。

　　01.WB驗(yàn)證：檢測外泌體標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況

　　鑒定外泌體首先需要通過WB來鑒定外泌體的標(biāo)志蛋白是否存在于樣品中，外泌體形成于早期胞內(nèi)體，在內(nèi)吞體轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體(ESCRT)及一些相關(guān)蛋白的調(diào)控下，早期胞內(nèi)體發(fā)生內(nèi)出芽形成多個腔內(nèi)小囊泡，構(gòu)成多胞體(MVB)，MVB最后在GTPase家族中的RAB酶調(diào)解下與細(xì)胞膜融合向外界釋放囊泡。

　　外泌體膜上富含參與外泌體運(yùn)輸?shù)乃目缒さ鞍准易?CD63、CD81和CD9))、熱休克蛋白家族((HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2和HSP90)以及一些細(xì)胞特異性的蛋白包括A33(結(jié)腸上皮細(xì)胞來源)、MHC-II(抗原提呈細(xì)胞來源)、CD86(抗原提呈細(xì)胞來源)以及乳凝集素(不成熟的樹突狀細(xì)胞)。其中CD63、CD9、CD81以及TSG101、HSP70、ALIX等，是最常用到的細(xì)胞外囊泡標(biāo)志物。

　　這些標(biāo)志物蛋白其實(shí)主要是涉及到了囊泡的形成和分泌過程，他們產(chǎn)生于細(xì)胞中，定位于胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)附近，如四旋蛋白(CD9，CD63和CD81)，直接參與了細(xì)胞外囊泡內(nèi)容物的分選;TSG101是ESCRT復(fù)合體相關(guān)的蛋白，而ESCRT復(fù)合體是膜形成和斷裂的驅(qū)動器。ALIX直接涉及到了膜泡在形成過程中切割脫離質(zhì)膜形成獨(dú)立膜結(jié)構(gòu)的過程。

　　02電鏡：分析外泌體的大小/形態(tài)等

　　掃描電鏡(scanning electron microscopy,SEM)或透射電鏡(transmission electron microscopy,TEM)等電子顯微鏡可用于外泌體鑒定。SEM的工作原理是用能量為1~30 KV間的電子束，以光柵狀掃描方式照射到被分析試樣的表面上，利用入射電子和試樣表面物質(zhì)相互作用所產(chǎn)生的二次電子和背散射電子成像，獲得試樣表面微觀組織結(jié)構(gòu)和形貌的高分辨率信息。由于超高真空技術(shù)的發(fā)展，場發(fā)射電子槍的應(yīng)用得到普及，現(xiàn)代先進(jìn)的SEM的分辨率已經(jīng)達(dá)到1 nm左右，足夠用來進(jìn)行外泌體尺寸的測量。TEM是把經(jīng)加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產(chǎn)生立體角散射。散射角的大小與樣品的密度、厚度相關(guān)，因此可以形成明暗不同的影像，影像放大、聚焦后在成像器件(如熒光屏、膠片、感光耦合組件)上顯示出來。

　　操作步驟大致是：

　　用PBS重懸提取的外泌體，滴于孔徑2 nm的載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置2 min，用濾紙從濾網(wǎng)側(cè)邊吸干液體，用3%磷鎢酸溶液在室溫下負(fù)染5 min，濾紙吸干負(fù)染液，室溫晾干，電鏡觀察拍照。外泌體在電鏡下具有非常明顯的膜邊界、呈30~100 nm大小不一的茶托或杯狀結(jié)構(gòu)(也會有200 nm以下、較難鑒別的其他形狀的外泌體)，但電鏡對樣品的預(yù)處理和制備要求較高，樣品分離方法和樣品性質(zhì)可能影響電鏡結(jié)果的好壞;樣品的準(zhǔn)備階段比較復(fù)雜，不適合對外泌體進(jìn)行大量快速的測量;且因外泌體經(jīng)過了預(yù)處理和制備過程，無法準(zhǔn)確測量。

　　以上兩種方法是最常用的外泌體的鑒定方法，是展開外泌體功能研究的前提。比如在腫瘤研究中，通過提取鑒定不同細(xì)胞系中的外泌體，進(jìn)而通過PCR以及測序篩選分析RNA，探究外泌體在腫瘤進(jìn)展或者耐藥中的發(fā)生機(jī)制。

　　外泌體像一把“雙刃劍”，與癌癥進(jìn)展有著密切的聯(lián)系，參與促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖與擴(kuò)散，對癌癥的發(fā)生及惡化有著重要的作用。但外泌體又可以應(yīng)用于癌癥的診斷與治療，目前外泌體在癌癥診斷與治療中的應(yīng)用尚處于初級階段，未來仍需要對外泌體的作用進(jìn)行更深入地探究，使其更好地應(yīng)用于臨床。

　　03納米顆粒示蹤分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)檢測外泌體粒徑及濃度

　　在外泌體研究領(lǐng)域，NTA技術(shù)已被用作外泌體表征手段之一;相較于其他表征方式，NTA技術(shù)的樣本處理更簡單，更能保證外泌體原始狀態(tài)，檢測速度更快。大致方法是：將收集的外泌體用PBS稀釋至106/mL，用1 mL注射器注入納米顆粒跟蹤分析儀(如裝有450 nm激光器的Nanosight NS300顆粒粒度分析儀);激光光束穿過樣本室外泌體顆粒，通過裝有攝像頭的顯微鏡實(shí)現(xiàn)顆?？梢暬?，捕捉外泌體的布朗運(yùn)動，利用愛因斯坦方程式根據(jù)其運(yùn)動計(jì)算濃度和流體力學(xué)直徑。SBI公司新開發(fā)的一種排除非外泌體顆粒干擾的試劑盒，還可幫助實(shí)現(xiàn)對完整外泌體的NTA分析。

　　04.流式細(xì)胞儀檢測外泌體的生物標(biāo)志物

　　流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)比較快速，適合高通量篩選，且可分析顆粒的大小與體積。用外泌體表面特異性標(biāo)志物相應(yīng)的抗體進(jìn)行標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀檢測其陽性表達(dá)，從而驗(yàn)證外泌體。如染色后的外泌體溶液加入分支聚乙烯亞胺(PEI)，37oC孵育15 min，之后超速離心去除PEI，然后加入金納米顆粒，輕柔重懸后置于培養(yǎng)箱中60 min，加入別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin,APC)DNA染料，室溫孵育15 min后流式細(xì)胞儀檢測。APC陽性的顆粒即為所需檢測的外泌體。