免疫熒光法適合于冰凍切片染色，因為這種切片通常保存抗原的能力更好。若選擇石蠟切片，則應(yīng)優(yōu)先考慮免疫酶法等染色技術(shù)。

　　使用熒光標(biāo)記的商品抗體進(jìn)行染色前，應(yīng)該先確定抗體的效力，找到適合的稀釋倍數(shù)后再進(jìn)行成批染色。一般來說，當(dāng)陽性物質(zhì)呈明亮熒光而背景較暗時的稀釋倍數(shù)是最適合的。高稀釋倍數(shù)的熒光抗體可減少非特異性染色，使染色結(jié)果更具特異性，但若稀釋倍數(shù)過高則可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

　　熒光抗體稀釋度較低時，有利于觀察結(jié)果，但可能會導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的染色，甚至產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

　　除去非特異性熒光。要去除非特異性熒光有很多種方法。通常情況下，冰凍切片的非特異性熒光會更明顯，而石蠟切片的非特異性熒光相對較輕。常見的處理方法包括：

　　先使用非免疫血清(如10%牛血清)處理組織切片，然后進(jìn)行熒光染色。

　　通過小鼠相應(yīng)組織的干粉吸收熒光抗體中的非特異性成份。

　　確定適當(dāng)?shù)南♂尡壤颓衅穸取?/b>

　　選擇具有高特異性和高效力的熒光抗體。

　　(清洗必須要徹底。每一步驟都需要使用蒸餾水或緩沖液進(jìn)行清洗，以清除殘留在切片中的試劑，以達(dá)到特異著色的目的。在清洗時，無論是沖洗還是振蕩清洗，都應(yīng)遵循基本原則，確保清洗徹底，或者說充分稀釋上一步驟中的試劑，使其濃度降至最低。

　　只要有充足的時間，建議使用靜置廷長的洗滌時間，以防止脫片，這是一個較好的方法。洗滌液的PH值應(yīng)該在7.2~7.4之間，太高或太低都不利于染色過程，特別是在偏堿性的PH值條件下。

　　孵化時間和溫度。通常最佳的時間和溫度是37℃，持續(xù)20至30分鐘。當(dāng)然，這也與抗體的強(qiáng)度、組織抗原的含量和位置、切片的厚度等因素有關(guān)。